[发明专利]一种小RNA高通量测序检测微生物的方法

摘要

本发明涉及一种新的通过RNA捕获‑小RNA高通量测序(RNA capture and sRNA‑seq，RC&sRNA‑seq)检测病毒、细菌和真菌等微生物的方法。该方法可以一次性检测样品中几千种微生物，并可以达到极高的灵敏度。

主权项

1.一种通过RNA捕获‑小RNA测序检测微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取生物样品中的总RNA，通过酶切或物理打断得到片段化的RNA；(2)将步骤(1)中所述片段化的RNA与带有标记物的DNA探针进行杂交，得到经标记的RNA‑DNA杂交产物；(3)将步骤(2)中所述经标记的RNA‑DNA杂交产物与表面带有与所述标记物特异性结合的配体的磁珠混合，使磁珠吸附所述经标记的RNA‑DNA杂交产物，洗脱除去未杂交的DNA探针与污染物；(4)加热使磁珠上的RNA‑DNA杂交产物变性，洗脱回收RNA，向回收物中加入DNA酶降解DNA片段；(5)将接头连接到步骤(4)中回收的RNA的3′端，得到带有3′端接头的RNA；(6)将步骤(5)中所述带有3′端接头的RNA与反转录引物退火杂交，得到RNA‑引物杂交产物；(7)将5′端接头连接到步骤(6)得到的所述RNA‑引物杂交产物的RNA的5′端，得到带5′端接头的RNA‑引物杂交产物；(8)以步骤(7)中所述带5′端接头的RNA‑引物杂交产物中RNA片段为模板进行反转录PCR，得到扩增的cDNA片段，选择长度在130‑200bp范围内的cDNA片段进行测序，测序长度在50bp以上；(9)去除步骤(8)中测序获得的序列3′端的测序接头，再去除15bp长度以下的序列，得到清理后的序列；(10)使用bowtie或BWA软件，将清理后的序列与目标微生物基因组序列进行比对，将与所述目标微生物基因组序列的比对区域相比存在至多1个碱基不同的所述清理后的序列确定为目标小RNA序列；对目标小RNA序列进行计数，将5′端或3′端比对到所述目标微生物基因组序列中相同位置的所有目标小RNA序列计数为一次；如果样品中目标小RNA序列计数值超过指定阈值，则将该样品中该目标微生物的检测结果确定为阳性。