[发明专利]一种体外高效扩增培养细胞毒性T淋巴细胞的方法

摘要

本发明公开了一种体外高效扩增培养细胞毒性T淋巴细胞的方法，涉及细胞培养技术领域。具体步骤为：配置培养基，取样，单个核细胞用生理盐水浸泡，采用离心机进行离心后充分漂洗3遍；将分离获得的单个核细胞培养，第20天收获细胞，收集5瓶细胞培养物，在室温下，采用离心机在1500rpm下，离心10min；计数，取少量细胞，稀释至200倍，可收获细胞数量约为3‑4×10⁹个，利用流式细胞术检测CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺、CD4⁺CD25⁺细胞比例，此类细胞为细胞毒性T淋巴细胞，具有取材容易、对机体损伤小、少量外周血可获取大量的具有高活性的细胞毒性T细胞、适宜大规模培养。

主权项

1.一种体外高效扩增培养细胞毒性T淋巴细胞的方法，且特征在于：具体步骤为：步骤一：配置培养基，每1mL X‑VIVO 15无血清培养基内含IL‑2 1000IU，包被培养瓶，用50g/mL CD3预处理T225cm2带有空气滤膜的细胞培养瓶，4℃包被过夜后，备用；步骤二：取样，取100mL静脉血，其中活率≥90％，用于制备单个核细胞，取等量淋巴细胞分离液，小心转移静脉血至分离液之上，轻柔操作避免打破交界液面，采用离心机进行离心，在1800×rpm离心15min，小心吸取中间白膜层，即单个核细胞层，转移至新离心管中；步骤三：单个核细胞用生理盐水浸泡，采用离心机进行离心在1800×rpm，离心10min，充分漂洗3遍；步骤四：将分离获得的单个核细胞用一定体积的X‑VIVO 15无血清培养基培养，无血清培养基培养中内含IL‑2，终浓度1000IU/mL，按1‑2.0×106个/mL的浓度接种于包被过的T225cm2细胞培养瓶中，细胞培养瓶中内含CD3，终浓度50g/mL，放置在37℃下，在5％±0.5％CO2的饱和湿度的培养箱内培养；步骤五：第4天向T225cm2细胞培养瓶中补入步骤二中等体积X‑VIVO 15无血清培养基，无血清培养基内含IL‑2，终浓度1000IU/mL，做好标记，放入CO2培养箱中继续培养；步骤六：第6天，观察培养基颜色并计数，向T225cm2细胞培养瓶中补入150mL 37℃预热的X‑VIVO 15无血清培养基，无血清培养基内含IL‑2，终浓度1000IU/mL，混匀，放入CO2培养箱中继续培养；步骤七：第7天扩增培养，培养瓶内细胞处于1.0×106个/mL左右时最适宜进行扩增操作，数量过低应将培养瓶放回培养箱，继续培养，取出细胞培养瓶，表面消毒，放入生物安全柜中，用移液器轻轻吹打细胞，混匀，均分至5个T225cm2细胞培养瓶中，每瓶补足37℃预热的X‑VIVO 15无血清培养基，无血清培养基内含IL‑2，终浓度1000IU/mL，至200mL，混匀，放入CO2培养箱中培养；步骤八：第13天向5个细胞培养瓶中补入37℃预热的X‑VIVO 15无血清培养基，无血清培养基内含IL‑2，终浓度1000IU/mL，至200mL，混匀，放入CO2培养箱中培养；步骤九：第20天收获细胞，收集5瓶细胞培养物，在室温下，采用离心机在1500rpm下，离心10min；步骤十：计数，取少量细胞，稀释至200倍，可收获细胞数量约为3‑4×109个；步骤十一：利用流式细胞术检测CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+细胞比例，此类细胞为细胞毒性T淋巴细胞，利用无血清冻存液冻存该细胞于液氮中。