[发明专利]一种畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测的方法

摘要

本发明公开了一种畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测的方法，包括：建立抗生素标准曲线、样品检测等内容。新方法通过筛选得到提取液成分与比例，使得不同性质抗生素同时被提取，实现更多种抗生素同时精准检测。在检测时，降低了检测时45种抗生素整体的RSD，显著降低检测误差，提高了检测的精度。新方法中，在12min内实现了对五大类抗生素中的45种抗生素分离检测，具有可操作性强、高效、快速和准确度高等特点。

主权项

1.一种畜禽粪便中45种抗生素同时精准检测的方法，其特征在于按如下的步骤进行：一、建立抗生素标准曲线（1）45种抗生素标准品：盐酸土霉素、多西环素、金霉素、去甲基金霉素、四环素、氧氟沙星、恩诺沙星、二氟沙星、司帕沙星、萘啶酸、氟罗沙星、盐酸洛美沙星、沙拉沙星、环丙沙星、达氟沙星、依诺沙星、氟甲喹、西诺沙星、奥比沙星、噁喹酸、诺氟沙星、磺胺二甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺噁唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺二甲（基）嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺对甲氧嘧啶、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、螺旋霉素、替米考星、苯唑西林、青霉素G、氯唑西林，纯度均大于等于95%；（2）45种抗生素标准储备溶液：分别称取适量标准品，分别用对应的溶剂溶解，其中β‑内酰胺类用乙腈:水体积比为1:3溶解，其他的用甲醇溶解，配制成100 mg/L，置于冰箱‑20 ℃保存；（3）标准工作溶液：准确称取抗生素标准储备液适量，用甲醇配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液，用时现配；（4）高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITY UPLC HSS T3，2.1（内径）×100mm，1.8μm 或相当；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序：0～1.5 min, 90% A；1.5～8 min, 90‑30% A；8～8.1min, 30～90% A；8.1～12 min, 90% A；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；（5）所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度为500 ℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气；碰撞气为高纯氩气；二、样品检测（1）称取畜禽粪便鲜样，冷冻干燥，粉碎过2 mm筛；（2）加入质量体积比为1:20（g:mL）的Tris溶液、乙酸盐溶液、乙腈、甲醇、EDTA‑Mcllvaine混合提取液，旋涡混匀；其中混合提取液Tris溶液：乙酸盐溶液：乙腈：甲醇：EDTA‑Mcllvaine=1:1:1:1:1～1:1:1:1:2（体积比），蜗旋混合时间为30 s～5 min；Tris溶液：将50mL的0.1mol/L Tris碱溶液与45.7mL的0.1 mol/L HCl混合，加水将体积调至100 mL；乙酸盐溶液：取醋酸铵25g，加水25mL溶解后，加7mol/L盐酸溶液38mL，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节PH值至3.5，用水稀释至100mL，即得；EDTA‑Mcllvaine：称取一定量的Na2HPO4、Na2EDTA和柠檬酸，分别配制成0.2、0.4和0.2mol/L的溶液，柠檬酸溶液与Na2HPO4溶液按照体积比8:5混合，配制成Mcllvaine缓冲液；1L Mcllvaine缓冲液与Na2EDTA溶液体积比1:1混合，得到0.1mol/L的Na2EDTA‑Mcllvaine提取液；（3）超声波处理15 min，以3000～10000 rpm离心5～15 min获取上清液，在上述提取液中重复提取2‑3次，合并上清液，待用；（4）提取获得的上清液加入MgCl2和蛭石，体积比为30:1:1(mL:g:g)，混合均匀后，将其置于‑20℃冷冻1h，过滤获得液体部分；（5）将上述液体通过waters PRiME HLB固相萃取柱，速度0.5‑1 mL/min，抽真空5 min，用6 mL酸性甲醇、乙腈混合液洗脱柱子，其中甲醇:乙腈为3:7（含1‰甲酸），收集洗脱液；（6）第5步中将洗脱液于低于40 ℃下氮气吹干，用1.0 mL甲醇:水（1:1，v/v）加1‰甲酸复溶，0.22 μm有机滤膜过滤，用液相色谱‑质谱/质谱仪测定；所述高效液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，ACQUITY UPLC HSS T3，2.1（内径）×100 mm，1.8 μm 或相当；流动相：A组分是超纯水（含1‰甲酸）；B组分是乙腈；梯度洗脱程序见表1；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；梯度洗脱程序所述质谱条件为：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度为500 ℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气；碰撞气为高纯氩气。