[发明专利]一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞活性氧分泌量影响的方法

摘要

本发明公开一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞活性氧分泌量影响的方法，包括以下步骤：(1)样品前处理；(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备；(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算；(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种；(5)受试物暴露；(6)装载探针；(7)样品测定；(8)活性氧水平计算。本发明样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞活性氧分泌量的影响，进而能够有效地评价加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞的氧化性损伤。

主权项

1.一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞活性氧分泌量影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0mL，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mTPM；mTPM＝m1‑m0     (1)式中：m0——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；m1——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50mL的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/mL；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1mL的冻存管中，‑80℃保存待用；(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备：人鼻腔上皮细胞RPMI2650复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中，加入10mLRPMI1640细胞培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的RPMI1640细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用RPMI1640细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤(2)所得人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种：将步骤(3)计数后的人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液用RPMI1640细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6mL，然后将细胞培养皿置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h；(5)受试物暴露：把步骤(1)中制备的样品用PBS稀释成400μg/mL的工作液备用，取出细胞培养皿，去除细胞培养液，将不同剂量的待测液和培养基加入细胞培养板中作为检测样品组，每个检测剂量设4孔平行，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；同时设置阳性对照组，阳性对照物原液为25mg/mL的Rosup溶液；(6)装载探针：步骤(5)暴露培养完成后移除细胞培养板中的细胞培养基，每孔加入终浓度为10μmol/L的2',7'‑二氯荧光黄双乙酸盐DCFH‑DA荧光探针100μL，37℃、5％CO2培养箱中孵育20min；(7)样品测定：移除步骤(6)细胞培养板中的液体，每孔中的细胞用PBS磷酸盐缓冲液洗3次，去除未进入细胞内的DCFH‑DA探针，然后在1h～6h内用荧光酶标仪于488nm激发波长下测定光度值；(8)活性氧水平计算：根据所得光度值，按照下列公式计算样品的活性氧水平，以相对荧光强度表征；刺激后OD值升高则计算活性氧升高率：活性氧升高率＝(刺激后OD值‑刺激前OD值)/刺激前OD值×100％；刺激后OD值降低则计算活性氧降低率：活性氧降低率＝(刺激前OD值‑刺激后OD值)/刺激前OD值×100％。