[发明专利]一种具有双抗生素筛选标记的原核表达载体及应用在审
| 申请号： | 201811476955.9 | 申请日： | 2018-12-05 |
| 公开（公告）号： | CN109402157A | 公开（公告）日： | 2019-03-01 |
| 发明（设计）人： | 华丽霞;曾华兰;何炼;蒋秋平;叶鹏盛;黄玲;张小军;张敏;何晓敏;王明娟 | 申请（专利权）人： | 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/65;C12N1/21;C12R1/19 |
| 代理公司： | 成都博通专利事务所 51208 | 代理人： | 陈树明 |
| 地址： | 610300 四川省成都*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | 一种具有双抗生素筛选标记的原核表达载体及应用，其表达载体由以下方法得到：A、以碱基序列为SEQ ID NO：1的(5’‑3’)引物及碱基序列为SEQ ID NO：2的(5’‑3’)引物，对pUC19载体质粒进行超保真扩增，得到碱基序列为SEQ ID NO：3的含氨苄青霉素抗性基因的核苷酸片段；B、以碱基序列为SEQ ID NO：4的(5’‑3’)引物及碱基序列为SEQ ID NO：5的(5’‑3’)引物，对pET‑30a环状载体质粒进行反向超保真扩增，得到pET‑30a线性化载体；C、将A步的核苷酸片段与B步的pET‑30a线性化载体连接，即得。该表达载体扩大了宿主菌选择范围，利于蛋白表达。 | ||
| 搜索关键词： | 碱基 引物 原核表达载体 核苷酸片段 抗生素筛选 线性化载体 表达载体 保真 扩增 质粒 氨苄青霉素抗性基因 蛋白表达 环状载体 宿主菌 应用 | ||
【主权项】：
1.一种具有双抗生素筛选标记的原核表达载体，由以下方法构建得到：A、制备含氨苄青霉素抗性基因的核苷酸片段以碱基序列为SEQ ID NO：1所示的(5’‑3’)引物及碱基序列为SEQ ID NO：2所示的(5’‑3’)引物，通过超保真DNA聚合酶对pUC19载体质粒进行扩增，得到长度为988bp的碱基序列为SEQ ID NO：3所示的核苷酸片段，即含氨苄青霉素抗性基因的核苷酸片段；B、pET‑30a载体的线性化以碱基序列为SEQ ID NO：4所示的(5’‑3’)引物及碱基序列为SEQ ID NO：5所示的(5’‑3’)引物，通过超保真DNA聚合酶对pET‑30a环状载体质粒进行反向扩增，得到长度为5422bp的pET‑30a线性化载体；C、双抗生素筛选标记的原核表达载体的制备通过一步法定向克隆技术将A步的含氨苄青霉素抗性基因的核苷酸片段与B步的pET‑30a线性化载体连接，得到同时具有氨苄青霉素抗性与卡那霉素抗性的环状的原核表达载体，即具有双抗生素筛选标记的原核表达载体pET30aA+K+。
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