[发明专利]一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法

摘要

本发明涉及一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法，本发明首次通过采用向枯草芽孢杆菌中插入启动子P43、信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，同时敲除裂解基因Xpf、SkfA、LytC和SdpC后，构建获得重组工程菌pHT01‑P43‑PhoD‑MTSase‑MTHase(LM1234)，并采用了特殊序列的刚性连接，从而实现了目标酶的功能表达；通过实际发酵生产海藻糖后，惊奇的发现，由于改造后的重组菌胞外酶活能够占到总酶活的70％，实现了胞外产酶与转化的同步进行，从而省去了传统发酵液中需要先进行酶分离然后再进行海藻糖生产的过程，实现了重组菌的发酵与海藻糖的生产同于耦合化。

主权项

1.一种高产麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌的构建方法，步骤如下：(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增得到基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC，所述基因Xpf的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述基因SkfA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述基因LytC的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述基因SdpC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，将上述基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC分别连接到敲除载体后，制得敲除载体质粒pMAD‑ΔXpf、pMAD‑ΔSkfA、pMAD‑ΔLytC、pMAD‑ΔSdpC，然后将敲除载体质粒pMAD‑ΔXpf、pMAD‑ΔSkfA、pMAD‑ΔLytC、pMAD‑ΔSdpC分别转化B.subtilis WB800n感受态细胞，经筛选，制得重组菌B.subtilis(LM1234)；(2)分别PCR扩增组成型启动子P₄₃、分泌信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，然后通过重叠PCR连接启动子P₄₃、分泌信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase之间通过特殊序列的刚性连接肽连接，构建重组质粒pHT01‑P₄₃‑PhoD‑MTSase‑MTHase；然后转化步骤(1)制得的重组菌B.subtilis(LM1234)，即得；所述特殊序列的刚性连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。