[发明专利]一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法

摘要

本发明公开了一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法，它包括分离单菌落、制备单菌落甘油管、筛选单菌落菌种、制备单菌落冷冻菌等步骤，在分离纯化过程中的单菌落甘油孢子悬液分装于3支甘油管，其中2支单菌落甘油管分别用于摇瓶初筛和摇瓶复筛，另外1支单菌落甘油管直接用于单菌落冷冻菌的制备。此过程减少了菌种在复壮选育过程中和制备过程中的传代次数，提高了灰黄霉素的发酵单位；减少和减慢了菌种分生孢子在保藏过程中的死亡率和死亡速度，保证了菌种生长繁殖和发酵效价的稳定，简化了菌种制备过程中的许多无菌操作环节，从而大大降低了菌种的染菌率。

主权项

1.一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：S1，分离单菌落：取预先选定的灰黄霉素出发菌种，接种茄瓶斜面，斜面孢子培养成熟后，选取外观质量合格的斜面孢子，用无菌水制成单孢子悬液，然后将悬液按10倍的浓度梯度稀释至10‑5、10‑6、10‑7，再分别将三个浓度的单孢子悬液涂布到平板培养基上，在28～30℃条件下培养6～7天；S2，制备单菌落甘油管：取步骤S1培养好的平板，选择菌型较大、孢子丰满、边缘整齐的主型菌落，用接种环挑下，放入预先加有玻璃珠的试管中，振荡打下孢子，再加1.5～2.5ml的8～12％甘油保护剂，摇动制成孢子悬液；用无菌吸管将孢子悬液分别吸入3支甘油管中，贴好标签，写好编号和日期，3支甘油管编写相同的单菌落编号，使用‑70℃丙酮预冻后放入‑70℃的超低温冰箱保藏；S3，筛选单菌落菌种：取步骤S2制备的相同单菌落编号的两只单菌落甘油管，分别用于摇瓶初筛和摇瓶复筛，根据摇瓶初筛和摇瓶复筛的筛选结果，选择与发酵效价高的单菌落甘油管编号对应的另外1支单菌落甘油管作为入选的单菌落冷冻菌的菌种；S4，制备单菌落冷冻菌：将步骤S3筛选出的单菌落冷冻菌的菌种接种茄瓶斜面，斜面孢子培养6～7天成熟后，加入适量灭菌的8～12％甘油制成菌悬液，然后再用吸管吸10～20ml菌悬液于冷冻瓶中，塞好塞子，并用封口膜包好，贴好标签，写好编号和日期，使用‑70℃丙酮预冻后放入‑70℃的超低温冰箱，制得灰黄霉素单菌落冷冻菌。