[发明专利]一种提高细胞分辨率染色质可及性的方法

摘要

本发明属于细胞生物学实验技术领域，具体涉及一种提高细胞分辨率染色质可及性的方法。本发明基于新的NEBNext FS片段化酶以及片段选择策略，针对性地进行了系统优化和配置，使染色质切割效率和精度最大化，最终获得高分辨率的染色质开放区域信息，同时极大地降低了实验成本。本发明为染色质开放区域的研究提供了新的技术路线，得到的数据质量高，还可以与二代建库测序的标准程序进行无缝对接，是研究染色质可及性的便捷方法。

主权项

1.一种细胞高分辨率染色质可及性的方法，其特征包括以下步骤：(1)用澳洲胎牛血清培养基培养猪肺泡巨噬细胞，培养2‑3天，用500μl胰酶消化，再用澳洲胎牛血清培养基重悬细胞，用细胞计数板计算细胞量，收集500‑50000个细胞，在500g，4℃下离心5min；(2)弃上清，取沉淀，用50μl冷磷酸盐缓冲液重悬细胞团，用移液枪上下吹匀，进行清洗，然后在500g，4℃下离心5min；将所得的沉淀再次用50μl冷磷酸盐缓冲液重悬，吹匀，然后在500g，4℃下离心5min，最后弃上清；(3)加50μl冷裂解液重悬细胞团，用移液枪上下吹匀，然后在Rocker 10上4℃旋转8min，然后在500g，4℃下离心5min，最后弃上清；(4)用24μl TE缓冲液重悬细胞团，向其中加入NEBNext Ultra II FS反应缓冲液7μl；NEBNext Ultra II FS酶混合液4μl，最后放置在热循环仪上孵育，孵育条件为：37℃，14min；65℃，30min；4℃，保持；(5)使用Qiagen PCR产物纯化试剂盒回收片段化后的染色质，用35μl Qiagen洗脱缓冲液洗脱DNA；(6)直接向步骤(5)中35μl缓冲液洗脱DNA中加入NEBNext Ultra II连接混合液30μl；NEBNext连接体系1μl；NEBNext适配器2.5μl；至总体积68.5μl，用枪吹匀，并放置在热循环仪上孵育，孵育条件为：20℃，15min，PCR盖子温度关闭；(7)向步骤(6)连接后的体系中加3μl尿嘧啶‑特异性切除酶，用枪吹匀，短暂离心；将离心后的产物放置在热循环仪上孵育，孵育条件为：37℃，15min，热循环仪盖子温度应大于等于47℃；(8)用体积比为1:1.8的128.7μl AMPure磁珠纯化回收连接后的产物，用17μl 0.1X TE缓冲液洗脱；(9)使用NEBNext Ultra II FS DNA文库制备试剂盒进行PCR扩增；(10)用体积比为1:150μl AMPure磁珠回收扩增后的产物，用33μl 0.1X TE缓冲液洗脱DNA；(11)使用高敏感DNA芯片在Agilent 2100检测扩增后文库的片段大小的分布；(12)使用Sage Science BluePippin仪器对文库进行片段选择，选择280‑350bp的片段进行测序；其中：步骤(1)中的澳洲胎牛血清培养基成分按质量计为：澳洲胎牛血清10％，非必需氨基酸1％，补充RPMI 1640培养基178ml；步骤(3)中的裂解液按质量计为：Tris·HCl pH 7.5 10mM；氯化钠10mM；氯化镁3mM；聚乙氧基乙醇辛基苯基‑聚乙烯二醇0.1％；补充双蒸水9.75ml。