[发明专利]一种通过体细胞胚发生途径获得白刺花再生植株的方法

摘要

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种通过体细胞胚发生途径获得白刺花再生植株的方法。包括：1、获得无菌外植体；2、获取能够快速形成胚性愈伤组织的培养基；3、获得状态良好的胚性细胞；4、获得白刺花体细胞胚发生培养基；5、体细胞胚成熟培养；6、体细胞胚萌发及生根培养。该发明通过体细胞胚发生途径获得白刺花再生植株，有效避免行常规种子繁殖性状易分离，萌发率低，出苗不整齐等问题，通过胚性愈伤组织诱导、增殖培养，体细胞胚发生、成熟、萌发及生根等过程，避免了污染、褐化、玻璃化及畸形胚。

主权项

1.一种通过体细胞胚发生途径获得白刺花再生植株的方法，包括以下步骤：步骤一 获得无菌外植体，将健康饱满无损害的白刺花种子划破种皮，用70%的酒精消毒30s后、转入0.1%的HgCl2溶液中消毒12min，无菌水冲洗5‑6次吸干水分后接种于不添加任何激素MS+3%蔗糖+0.7%琼脂的培养基上，在温度为25℃、10mmol·m‑2·s‑1的弱光下培养14d后取下胚轴作为外植体；步骤二 获取能够快速形成胚性愈伤组织的培养基，将无菌下胚轴切成0.5 cm ‑1.0cm大小，平放于诱导培养基上，诱导培养基以MS为基本培养基，蔗糖浓度为40 g·L‑1，琼脂为7.0 g·L‑1，pH 5.8，生长调节剂组合试验设计采用正交设计，四因子四水平16次试验，接种后先暗培养10 d，然后转到20 mmol·m‑2·s‑1光照下培养，光照时数为14 h·d‑1，培养温度25±1℃；培养45d后，形成胚性愈伤组织，统计愈伤组织和胚性愈伤组织的形成情况，利用改良苯酚品红染液显微镜下观察胚性细胞及非胚性细胞形态；步骤三 获得状态良好的胚性细胞，将胚性愈伤组织分别接种于MS培养基，MS培养基参数为0.5 mg/L TDZ、0.5 mg/L 6‑BA、2,4‑D、40 g/L蔗糖、100 mg/L谷氨酰胺、7 g/L琼脂、pH 5.8、2,4‑D浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/L，光照强度为10 mmol/m2·s，白天14 h/黑暗10 h，25 d左右继代一次，共继代2次；步骤四 获得白刺花体细胞胚发生培养基，包括：①将状态良好的胚性愈伤组织接种于不同生长调节剂组合：NAA0‑0.5 mg/L、6‑BA 0‑1.0 mg/L和TDZ 0‑0.5 mg/L的体细胞胚发生培养基上，蔗糖浓度为40 g·L‑1，琼脂为7.0 g·L‑1，谷氨酰胺100 mg·L‑1，pH 5.8，每瓶接种胚性愈伤组织3‑5块，每个处理3次重复，20 mmol·m‑2·s‑1的光下培养，光照时数为14 h·d‑1，温度25±1℃；②将状态良好的胚性愈伤组织接种于不同氮素水平的MS培养基上，培养基中KNO3和NH4NO3的比例分别为+KNO3和‑NH4NO3， +2KNO3和‑NH4NO3， +2KNO3,和+1/2NH4NO3， +KNO3和+1/2NH4NO3， ‑KNO3和+2NH4NO3， ‑KNO3和+NH4NO3，其余参数NAA 0.5 mg·L‑1 + 6‑BA 1.0 mg·L‑1 + TDZ 0.5 mg·L‑1 + 蔗糖40 g·L‑1 +谷氨酰胺100 mg·L‑1 + 琼脂 7.0 g·L‑1，20 mmol·m‑2·s‑1的光下培养，光照时数为14 h·d‑1，温度25±1℃；③将状态良好的胚性愈伤组织转接到体细胞胚发生的分化培养基上，MSsalt(+2KNO3,+1/2NH4NO3)为基本培养基, NAA 0.5 mg·L‑1 + 6‑BA 1.0 mg·L‑1 + TDZ 0.5 mg·L‑1 + 蔗糖40 g·L‑1 +谷氨酰胺100 mg·L‑1 + 琼脂 7.0 g·L‑1，ABA分别为0、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg·L‑1，蔗糖4%，谷氨酰胺100mg·L‑1，琼脂0.7%，pH5.8，20 mmol·m‑2·s‑1光下培养，光照14h·d‑1，温度25℃；④将状态良好的胚性愈伤组织转接到体细胞胚发生的分化培养基上， MSsalt(+2KNO3,+1/2NH4NO3)为基本培养基，NAA 0.5 mg·L‑1 + 6‑BA 1.0 mg·L‑1 + TDZ 0.5 mg·L‑1 + 蔗糖40 g·L‑1 +谷氨酰胺100 mg·L‑1 + 琼脂 7.0 g·L‑1，PEG‑6000分别为0、5、10、20、30、40、50、80、100g·L‑1，蔗糖浓度分别为10、20、30、40、50、80、100g·L‑1，肌醇0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，15.0，18.0 20.0g·L‑1，20 mmol·m‑2·s‑1光下培养，光照14h·d‑1，温度25℃；步骤五 体细胞胚成熟培养，将白刺花体细胞胚分化培养得到的球形胚接种于体细胞胚成熟培养基上，成熟培养基比较蔗糖、麦芽糖、山梨醇和PEG不同浓度及组合：蔗糖2%、3%、4%、5%、6%、7%，麦芽糖2%、5%、7%与蔗糖4%组合，山梨醇2%、5%、7%与蔗糖4%组合，麦芽糖2%与山梨醇2%和蔗糖4%组合，PEG‑6000为20、30、40、50、60、70 g·L‑1，ABA 15 g·L‑1，NAA 1.0 mg·L‑1， 6‑BA 2.0 mg·L‑1，TDZ 1.0 mg·L‑1，谷氨酰胺100mg·L‑1，植物凝胶3 g·L‑1，活性炭2 g·L‑1， 20 mmol·m‑2·s‑1的光下培养，光照14h·d‑1，温度25±1℃；步骤六 体细胞胚萌发及生根培养，挑取肉眼可见的已发育至球形期的体细胞胚分别接种于体胚萌发培养基上，培养基为改良MS培养基：大量元素用量分别为1/5、1/4、1/3、1/2和MS，NAA 0.2 mg·L‑1 ＋ 6‑BA 0.1 mg·L‑1 ＋活性炭0.2%＋ 蔗糖25 g·L‑1 ＋ 琼脂7 g·L‑1，pH 5.8, 30 mmol·m‑2·s‑1光照下培养，获得完整幼苗。