[发明专利]一种蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶及其制备方法

摘要

一种蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶及其制备方法，明属于生物医药技术领域。本发明所制备获得pH响应性纳米凝胶是通过单端为胺基的聚乙二醇单甲醚作为大分子引发剂一步引发γ‑苯甲基‑L‑谷氨酸酯‑N‑内羧酸酐或γ‑苯甲基‑L‑天冬氨酸酯‑N‑内羧酸酐开环聚合去制备聚氨基酸主骨架，随后主骨架尾端用于接枝光敏剂，而侧链则用阳离子分子修饰去增加蛋白质的负载能力和溶酶体逃逸能力。最后，通过内核交联反应去构建pH响应性的纳米凝胶体系，从而实现体内安全传送、靶向投放、快速细胞摄取，体内释放蛋白质和激活光敏剂的目的。这将有利于推动蛋白质与光动力联合治疗在医疗领域的发展。

主权项

1.一种蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶的制备方法，其步骤如下：(1)将L‑谷氨酸γ‑苄酯或L‑天冬氨酸α‑苄酯与三光气共混于无水四氢呋喃溶剂中，L‑谷氨酸γ‑苄酯或L‑天冬氨酸α‑苄酯与三光气的质量用量比例为1：0.62～0.7，无水四氢呋喃溶剂中L‑谷氨酸γ‑苄酯或L‑天冬氨酸α‑苄酯的浓度范围为0.1～0.2mg/mL；在温度60～80℃条件下反应90～150分钟，之后把溶液倒入大量的正己烷中，在‑30～‑15℃条件下重结晶，之后过滤，并用正己烷清洗并抽滤，所得粉末溶解于无水乙酸乙酯与正己烷体积比1：2～5的共混溶液中，再放入‑30～‑15℃条件下重结晶；最后过滤除去溶剂，并在室温条件下，抽真空20～30h，得到纯净的γ‑苯甲基‑L‑谷氨酸酯‑N‑内羧酸酐或γ‑苯甲基‑L‑天冬氨酸酯‑N‑内羧酸酐氨基酸单体；(2)将1～3g的单端为胺基的聚乙二醇单甲醚与γ‑苯甲基‑L‑谷氨酸酯‑N‑内羧酸酐或γ‑苯甲基‑L‑天冬氨酸酯‑N‑内羧酸酐氨基酸单体溶于10～15mL无水三氯甲烷或无水二氯甲烷中，在氮气保护、25～35℃下反应70～80小时，单端为胺基的聚乙二醇单甲醚与γ‑苯甲基‑L‑谷氨酸酯‑N‑内羧酸酐或γ‑苯甲基‑L‑天冬氨酸酯‑N‑内羧酸酐氨基酸单体的摩尔用量比例为1：40～60；反应结束后，溶液倒入于1～2L乙醚溶液中，通过沉降获得聚氨基酸主骨架；最后，将反应溶液过滤，所得固体真空干燥得到纯净的聚氨基酸主骨架；(3)将15～30mg缩合剂与30～50mg含有羧基基团的光敏剂共同溶解于10～20mL无水二甲基亚砜中，在室温条件下反应2～5小时去活化光敏剂中的自由羧基基团；随后把含有1～1.5g聚氨基酸主骨架的20～30mL无水二甲基亚砜溶液滴加到上述溶液中，并在室温条件下继续反应20～30h；然后在去离子水溶液中，采用截留分子量3000～4000的透析膜，透析纯化60～90h；透析后的溶液在‑60～‑40℃下冷冻干燥，得到光敏剂修饰的聚氨基酸配体模版，‑30～‑15℃下保存；(4)把1～1.2g光敏剂修饰的聚氨基酸配体模版溶解于10～15mL无水二甲基亚砜中，随后将含有双氨基基团的侧链阳离子单体注射到上述溶液中，并在氮气保护，40～55℃下反应70～80小时；反应后的溶液装入截留分子量为7000～10000的透析膜中，用过量的0.01～0.05M盐酸水溶液透析纯化48～72小时，透析后的溶液在‑60～‑40℃冷冻干燥，得到光敏剂修饰的阳离子聚氨基酸；光敏剂修饰的聚氨基酸配体模版与含有双氨基基团的侧链阳离子单体的用量摩尔比为1：20～30；(5)将0.5～1mL含有对苯二甲醛分子的四氢呋喃溶液逐滴加入到含有100mg光敏剂修饰、pH＝7.4～8.5的阳离子聚氨基酸的水溶液中，在室温下强烈搅拌30～40分钟，随后四氢呋喃溶剂通过旋转蒸发去除，剩余的水溶液置于截留分子量30000～50000的透析膜，通过大量的去离子水透析纯化60～72h，然后在‑60～‑40℃冷冻干燥，得到pH响应性聚氨基酸纳米凝胶；对苯二甲醛分子与聚氨基酸侧链上阳离子单体剩余的氨基基团的摩尔比为0.6～1：1；(6)把带有负电荷的蛋白质与pH响应性聚氨基酸纳米凝胶混合在pH为7.4～8.0的水溶液中，并且在室温下搅拌40～60分钟，来实现pH响应性聚氨基酸纳米凝胶对于蛋白质的负载；随后用截留分子量为300000～500000的透析膜，在大量的PBS溶液中透析24～48小时去除剩余的蛋白质；透析产物于‑‑60～‑40℃下冷冻干燥，得到蛋白质与光敏剂共传递pH响应性聚氨基酸纳米凝胶，在‑30～‑15℃下保存；带有负电荷的蛋白质与pH响应性聚氨基酸纳米凝胶的质量用量比例为0.2～0.5：1。