[发明专利]一种培养基再利用的牛大力多糖的生产方法

摘要

本发明公开了一种培养基再利用的牛大力多糖的生产方法，包括：步骤1)选取鸡血藤即将成熟种子，消毒进行萌发培养；步骤2)取嫩叶作为外植体进行诱导培养获得愈伤组织；步骤3)将愈伤组织进行继代培养至少二次，生长成为细胞团；步骤4)将细胞团进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系；步骤5)将悬浮细胞系进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系。步骤6)收集细胞，提取，离心，沉淀干燥后得到牛大力多糖。其中，萌发液体培养基包含：1/4～1/2MS、蔗糖和6‑BA，初始pH值为5.8，或者获取方法为：取一次利用后的所述启动液体培养基和/或利用后的增殖液体培养基，过滤，pH调节至5.8，灭菌加入6‑BA，作为萌发液体培养基。

主权项

1.一种培养基再利用的牛大力多糖的生产方法，其特征在于，包括：步骤1)首先选取鸡血藤即将成熟种子，然后对即将成熟种子进行消毒，再于温度0～2℃下处理24～48h，最后将其放置于萌发液体培养基中进行萌发培养至其长出1～10mm长度的嫩叶，所述即将成熟种子为开花后90～130天的鸡血藤植株的种子，所述消毒包括：首先采用含有质量体积浓度1～5g/mL次氯酸钙的溶液清洗所述即将成熟种子若干次，然后将清洗后的种子于温度70～80℃下处理20～30秒；步骤2)选取经过萌发培养长出的嫩叶作为外植体，将所述外植体置于诱导固体培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织，所述诱导固体培养基包含：MS，6‑BA 0.2～0.5mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L，蔗糖10～15g/L、蜂胶5～10g/L、酵母提取物2～5g/L、质量分数2～10％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；步骤3)将所述愈伤组织在继代固体培养基中进行继代培养至少二次，至其生长成为淡绿色的颗粒状的疏松的细胞团，所述继代固体培养基包含：MS，6‑BA 0.5～1mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L，蔗糖5～10g/L、蜂胶15～20g/L、酵母提取物5～10g/L、质量分数5～15％的银杏叶汁液和琼脂8g/L；步骤4)将所述细胞团转移至启动液体培养基中进行悬浮启动培养，获得悬浮细胞系，所述启动液体培养基包含：1/4～1/2MS、6‑BA 0.2～0.6mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液；步骤5)将所述悬浮细胞系接种至增殖液体培养基中进行增殖培养，获得鸡血藤悬浮细胞系，所述增殖液体培养基包含：1/2MS、6‑BA 0.5～1mg/L，NAA 0.02～0.1mg/L、蔗糖2～5g/L、蜂胶10～15g/L、酵母提取物2～5g/L和质量分数2～10％的银杏叶汁液；步骤6)将所述鸡血藤悬浮细胞系以转速2000～3000rpm、温度0～4℃下离心3～5分钟收集细胞，然后于恒温水浴90～100℃下，分别用纯净水提取3次，第一次提取用的纯净水用量与细胞的干重的比例为10:1，第一次提取时间为40min，第二次提取用的纯净水用流量与细胞的干重的比例为5:1，第二次提取时间为10min，第三次提取用的纯净水于细胞的干重的比例为2:1，第三次提取时间为5min，合并三次提取液，之后向其中加入体积百分比75％的乙醇，以转速6000～8000rpm、温度0～4℃下离心3～5min后弃去废液，将沉淀干燥后得到牛大力多糖；其中，所述萌发液体培养基包含：1/4～1/2MS、蔗糖7～15g/L和6‑BA 0.1～0.3mg/L，其初始pH值为5.8，或者，所述萌发液体培养基的获取方法为：取步骤4)中一次利用后的所述启动液体培养基和/或步骤5)中利用后的增殖液体培养基，以4～10目过滤筛过滤收集滤液，然后将所述滤液的pH调节至5.8，再将其置于温度110～117℃下进行封闭灭菌10～20min，得到灭菌后的培养基，再向其中加入6‑BA 0.1～0.3mg/L，以作为萌发液体培养基。