[发明专利]一种秦川肉牛肌内脂肪细胞分离的方法

摘要

本发明涉及一种秦川肉牛肌内脂肪细胞的分离纯化和鉴定方法，使用II型胶原酶对秦川肉牛背最长肌进行消化，经II型胶原酶消化后的组织块用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中和，经过滤、离心得到细胞，细胞再经洗涤、离心后重悬于含有10％FBS的DMEM/F12培养基中，计数后，将细胞接种在培养皿中，在CO2培养箱中培养1.5小时，用无菌磷酸缓冲盐溶液洗涤除去非粘附细胞，然后将细胞培养在37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，每隔2天换一次培养基，待细胞汇合度达到70％‑80％后，进行细胞免疫荧光标记阳性细胞鉴定。该方法获得的肉牛肌内脂肪细胞具有较高的前脂肪细胞阳性比率，为提高肌内脂肪沉积的同时不增加皮下及内脏脂肪沉积的研究奠定了基础。

主权项

1.一种秦川肉牛肌内脂肪细胞的分离方法，其特征在于，按下列步骤实施：1)将无菌条件下分离的4日龄秦川肉牛背最长肌组织，用PBS加2％的青霉素和链霉素清洁，然后切成1mm3～2mm3的组织块；2)将组织块加入离心管中，用II型胶原酶消化，经II型胶原酶消化后的组织块用含有10％FBS的DMEM/F12培养基中和，然后用70目和200目的不锈钢筛网进行过滤，将得到的滤液以1500rpm离心10分钟，弃去上清液，得到细胞；3)将得到的细胞用无血清DMEM/F12培养基重悬并以1500rpm离心10分钟，离心后洗涤两次；4)洗涤后的细胞重悬于含有10％FBS的DMEM/F12培养基中，计数后，将细胞以2.5×105个细胞的密度接种在培养皿中；将培养皿置于CO2浓度为5％的培养箱中培养1.5小时，然后用无菌PBS洗涤以除去非粘附细胞，并用新鲜的含有10％FBS的DMEM/F12培养基替换培养皿中的原培养基；5)将细胞培养在37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，每隔2天换一次新鲜的含有10％FBS的DMEM/F12培养基，待细胞汇合度到达到70％‑80％后，使用前脂肪细胞特异性标记Pref‑1进行细胞免疫荧光标记阳性细胞鉴定。