[发明专利]血栓心脉宁片的一致性表征方法

摘要

本发明涉及一种血栓心脉宁片的一致性表征方法，属于中药领域。样品经甲醇提取，采用UPLC色谱柱，以乙腈、甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，对30批样品进行方法学考察、相似度计算和聚类分析；单味药材进行共有峰归属，并通过对照品对共有峰的化学成分进行指认，建立血栓心脉宁片UPLC‑PDA指纹图谱，280nm波长下标定28个共有峰。优点是建立的血栓心脉宁片UPLC‑PDA指纹图谱具有良好的精密度、稳定性和重复性，方法简便可靠，经中药色谱指纹图谱评价软件计算得30批血栓心脉宁片相似度均大于0.960，可为进一步完善血栓心脉宁片的质量评价提供参考依据。

主权项

1.一种血栓心脉宁片的一致性表征方法，其特征在于，包括下列步骤：1、仪器与材料Waters Acquity H‑Class UPLC TM超高效液相色谱仪，XP105电子天平，5510E‑DTH超声仪，DK‑98电热恒温水浴锅，HC‑2066高速离心机，乙腈，色谱纯，甲醇、甲酸，均为分析纯；纯净水；30批血栓心脉宁片、药材饮片及取物均由吉林华康股份有限公司提供，各味药材经鉴定，分别为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎、唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎、豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花及花蕾、毛冬青科植物毛冬青Ilex pubescens Hook.et.Arn.干燥根、水蛭科动物水蛭Hirudo nipponica Whitman的干燥全体、蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥分泌物；阿魏酸对照品、芦丁对照品、丹酚酸B对照品、丹参酮IIA对照品、华蟾酥毒基对照品、酯蟾毒配基对照品；2、方法2.1色谱条件Waters Acquity UPLC HSS T3(50mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱；柱温40℃；体积流量0.5mL/min；进样量3μL；检测波长280nm；流动相为乙腈‑0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱：0～1min，5％乙腈；1～8min，5％～12％乙腈；8～27min，12％～18％乙腈；27～30min，18％～25％乙腈；30～45min，25％～45％乙腈；47～60min，45％～50％乙腈，理论塔板数按芦丁峰计算应不低于2000；2.2样品溶液的制备2.2.1混合对照品溶液的制备取阿魏酸、芦丁、丹酚酸B、丹参酮IIA、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基对照品适量，精密称定，分别置于量瓶中，甲醇溶解并定容，即可；精密量取各对照品溶液1mL置于10mL量瓶中，摇匀，甲醇定容，即得混合对照品溶液；2.2.2供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置25mL棕色量瓶中，加甲醇约20mL，超声处理(功率490W，频率50kHz)30min，放冷，甲醇稀释至刻度，摇匀，提取液经高速离心机以10 000r/min的转速离心10min，取上清液经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液按“2.1”项下色谱条件测定；2.2.3单味药材供试品溶液制备取7味药材浸膏粉以及人参茎叶总皂苷、麝香、人工牛黄粉末，按“2.2.2”项下方法制备，得单味药材供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定；2.3指纹图谱分析2.3.1指纹图谱的建立及共有峰的确定取30个批次血栓心脉宁片，分别研细，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，记录280nm波长下的色谱图，采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价》(2012版)软件对30批血栓心脉宁片数据进行分析，设置S1(批号为160904)为参照图谱，采用多点校正方式(时间窗宽度设为0.1min)，以中位数法建立对照指纹图谱(R)，进行色谱峰匹配后生成对照图谱，得到280nm波长下30批血栓心脉宁片UPLC指纹图谱，确定280nm波长下28个共有峰，共有峰峰面积占总峰面积的85％以上，峰面积相对较大，峰形相对较好，符合共有峰的选择原则；2.3.2相似度评价与系统聚类分析通过国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价》(2012版)软件对30批血栓心脉宁片的相似度进行分析；对2个波长下30批血栓心脉宁片数据进行聚类分析，以标定的共有峰的峰面积为变量，采用组间均联法，以欧式距离的平方为测度，运用SPSS 21.0统计软件，进行系统聚类分析，30批样品可分为2类，批次3～4、9～10为一类，其他批次为一类，结合相似度分析结果可知第一类共有峰的峰面积与其他批次共有峰的峰面积相比的有差异，可能与原药材批次间差异有关，聚类分析得到样品之间的相关性与相似度的计算结果较为一致；2.3.3共有峰的指认与归属通过与混合对照品图谱相比较，可以确定4号峰是阿魏酸、5号峰是芦丁、13号峰是丹酚酸B、19号峰是酯蟾毒配基、20号峰是华蟾酥毒基、28号峰是丹参酮IIA，分析单味药材的数据，根据保留时间和紫外光谱信息把各单味药材的图谱与血栓心脉宁片图谱分析比较，确定指纹图谱共有峰的药材归属，在280nm波长下，指纹峰来自丹参(1、10、12～16、18、21～28号峰)、川芎(2～4、6、8、9、17号峰)、毛冬青(3、7、9、11、16号峰)、槐花(5号峰)、蟾酥(19、20号峰)。