[发明专利]猪丁型冠状病毒重组N蛋白及其多克隆抗体的制备方法在审
| 申请号： | 201811572375.X | 申请日： | 2018-12-21 |
| 公开（公告）号： | CN109651488A | 公开（公告）日： | 2019-04-19 |
| 发明（设计）人： | 秦毅斌;刘磊;卢冰霞;李斌;周英宁;段群棚;何颖;赵武;梁家幸;蒋冬福;卢敬专 | 申请（专利权）人： | 广西壮族自治区兽医研究所 |
| 主分类号： | C07K14/165 | 分类号： | C07K14/165;C12N15/70;C07K16/10 |
| 代理公司： | 广西南宁公平知识产权代理有限公司 45104 | 代理人： | 杨立华 |
| 地址： | 530001 广西壮族*** | 国省代码： | 广西;45 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种猪丁型冠状病毒(PDCoV)重组N蛋白的制备方法，该法对PDCoV的N基因片段进行扩增后经过原核表达、纯化后获得重组N蛋白。据此，发明人还建立了重组N蛋白多克隆抗体的制备方法，即应用PDCoV重组N蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清。实验表明，本发明成功扩增了PDCoV的N基因并进行原核表达及纯化，初步研究其免疫原性，为研制诊断试剂盒或制备多克隆抗体奠定了基础。 | ||
| 搜索关键词： | 多克隆抗体 制备 冠状病毒 原核表达 丁型 扩增 诊断试剂盒 弗氏佐剂 免疫动物 免疫原性 血清 乳化 种猪 应用 成功 研究 | ||
【主权项】：
1.一种猪丁型冠状病毒重组N蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：<1>PDCoV N基因片段的扩增对PDCoV的RNA进行反转录获得cDNA，然后采用特异性引物N‑P1和N‑P2对PDCoV N基因进行PCR扩增，所述特异性引物N‑P1和N‑P2分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列；<2>原核表达质粒pET32a‑N的构建将PCR扩增得到的PDCoV N基因片段连接pMD18‑T克隆载体，转化DH5α感受态细胞获得pMD18‑N克隆质粒；将pMD18‑N克隆质粒和pET‑32a(+)分别进行双酶切，回收N基因和pET‑32a(+)载体，利用T4连接酶将pET‑32a(+)和N基因连接过夜后转化到DH5α感受态细胞后提取质粒得到原核表达质粒pET32a‑N；<3>重组N蛋白的获取将原核表达质粒pET32a‑N转化BL21感受态细胞，加入IPTG诱导，菌液超声波裂解，离心，收集上清和沉淀，SDS‑PAGE电泳确定重组N蛋白主要在上清中表达，按照康为世纪公司His标签蛋白纯化试剂盒的纯化方法获得重组N蛋白。
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