[发明专利]一种急性髓细胞性白血病诊断模型的建立方法及其应用

摘要

本发明公开了一种急性髓细胞性白血病诊断模型的建立方法，该方法包括：一、收集血清；二、采用超高效液相色谱和质谱联用分析检测血清；三、分析急性髓细胞性白血病患者与健康对照者的血清谱图，确定生物标志物；四、确认生物标记物的化学信息；五、确认谷氨基酸、犬尿氨酸、油酸为最优生物标记物并建立诊断模型；本发明还公开了一种急性髓细胞性白血病诊断模型的应用方法，将受试者的血清带入急性髓细胞性白血病诊断模型，经计算判断受试者是否患病。本发明得到的诊断模型准确高效，避免了对患者的侵袭性；本发明的应用方法取材简单易得，灵敏度高，能无创、高效、准确的区分急性髓细胞性白血病患者与健康者，适宜推广使用。

主权项

1.一种急性髓细胞性白血病诊断模型的建立方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一、血清样本的收集：收集急性髓细胞性白血病患者血清和健康对照者血清得到标志物发现集的血清，然后置于‑80℃冰冻保存；步骤二、血清样本的分析：将步骤一中冰冻保存的标志物发现集的血清样本冻融后各取100μL，分别加入400μL含有12.5μg/mL内标物L‑2‑氯丙苯氨酸的甲醇涡旋1min，然后置于冰水浴中超声提取10min，再在4℃、14000×g的条件下离心15min，得到的上清液采用超高效液相色谱和质谱联用进行检测，得到标志物发现集中血清样本的检测数据；所述超高效液相色谱的检测条件为：超高液相色谱采用Agilent1290 Infinity液相色谱系统，色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 C₁₈柱，规格为2.1mm×100mm，1.7μm，柱温为40℃，流动相中的A相为甲酸质量含量0.1％的甲酸水溶液，B相为甲酸质量含量0.1％的甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脱法进行洗脱，流速为400μL/min，进样量为3μL，色谱柱平衡时间为5min，具体洗脱条件为：0～2min采用5％B相，2min～13min采用5％～95％B相，13min～15min采用95％B相；所述质谱的检测条件为：质谱采用Agilent 6530 Accurate‑Mass Q‑TOFMS串联四极杆‑飞行时间质谱仪，并采用正离子模式检测，检测参数中的毛细管电压为3500V，干燥气流速为11L/min，干燥气温度为350℃，喷雾气压为45psig，破碎电压为120V，锥孔电压为60V，数据采集范围质荷比m/z为50～1000，选取质荷比为121.0509和922.0098的内标离子作实时质量数校正；步骤三、生物标志物的筛选：采用Agilent MassHunter Qualitative software软件将步骤二中得到的标志物发现集中血清样本的检测数据由.d文件格式转化为通用.mzData格式并通过去同位素峰的处理，然后采用XCMS数据处理软件进行去噪音、质谱峰提取、反卷积处理、峰排列、对齐、合并、列表去噪音和缝隙填补处理，得到标志物发现集中血清样本的各个离子峰的峰面积以及质荷比和保留时间等数据矩阵，并以内标物L‑2‑氯丙苯氨酸的峰面积进行各个离子峰的归一化，得到标志物发现集中急性髓细胞性白血病患者血清谱图与健康对照者血清谱图，并对两者进行差异性的分析，然后采用版本为Version11.0的SIMCA‑P统计软件进行正交偏最小二乘法判别分析，得到变量重要性因子对差异性贡献最大的代谢物，再采用独立样本t检验进一步验证上述代谢物在标志物发现集中急性髓细胞性白血病患者血清和健康对照者血清的差异性，综合考虑变量重要性筛选和t检验结果，确定19种代谢物为急性髓细胞性白血病相关的生物标志物；步骤四、生物标志物的结构鉴定：采用Agilent MassHunter软件对步骤三中确定的19种生物标记物进行分子式预测，然后将19种生物标记物的标准品采用超高效液相色谱和质谱联用进行检测，得到19种生物标记物的标准品的分子量检测信息以及碎片离子信息，并与步骤三中得到的19种生物标记物的分子量检测信息以及碎片离子信息进行对比，最终确认19种生物标记物的化学信息；所述超高效液相色谱和质谱联用的检测条件分别与步骤二中所述超高效液相色谱和质谱检测条件相同；步骤五、诊断模型的建立：采用Logistic逐步回归分析法建立基于步骤四中得到的19种生物标记物的优化模型，得到谷氨基酸、犬尿氨酸、油酸3种代谢物为急性髓细胞性白血病诊断的最优的生物标记物，并基于这3种代谢物建立急性髓细胞性白血病诊断模型为：Logit[P＝AML]＝‑7402.177×[谷氨基酸]+6000.123×[犬尿氨酸]‑596.626×[油酸]+10.571，其中[P＝AML]代表基于该代谢物组合的急性髓细胞性白血病诊断效能，分布区间为0～1，[谷氨基酸]、[犬尿氨酸]和[油酸]分别代表血清中谷氨基酸、犬尿氨酸、油酸的相对浓度(内标物为L‑2‑氯苯丙氨酸)，然后通过受试者工作特征曲线对所述急性髓细胞性白血病诊断模型进行分析，得到所述急性髓细胞性白血病诊断模型的截断值为0.3731，受试者工作特征曲线下面积为0.981，灵敏度为0.975，特异度为0.933。