[发明专利]一种红曲色素产生菌株构建方法

摘要

本发明提供了一种红曲色素高产菌株构建方法。该技术方案首先将一对依次含有Hind III、Kpn I、Sac I、Pac I、Pme I、Xho I、Xba I、Bgl II酶切位点的寡核苷酸序列与植物双元质粒pCambia0380连接，构建得到双元质粒表达载体pCambia0380G；而后，将hph表达盒片段与之连接，获得双元质粒敲除载体pHph0380；在此基础上，分别扩增gltp1基因的上、下游同源臂片段，连接至双元质粒敲除载体pHph0380上，从而获得双元质粒敲除载体pHph0380‑GLTP。将该载体pHph0380‑GLTP由根癌农杆菌EHA105介导转化至亲本红色红曲霉CICC41233中，完成高产菌株的构建。实验验证表明，本发明所构建的红曲色素高产菌株不仅提高了红曲色素的整体产率，而且可定向累积醇溶性色素，同时，使发酵过程中红曲色素的积累时间显著提前。

主权项

1.一种红曲色素高产菌株构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切，而后将一对如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2所示的寡核苷酸序列通过T4 DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；2)以质粒pMD19‑PgpdA‑hph‑TtrpC为模板，以序列如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4所示的一对引物执行PCR扩增，得到hph表达盒片段，用限制性内切核酸酶Sac I与Xho I同时酶切所述hph表达盒片段以及双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4 DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒敲除载体pHph0380；3)以红色红曲霉CICC41233总DNA为模板，以序列如SEQ ID No:9、SEQ ID No:10所示的一对引物执行PCR扩增，得到糖转运蛋白gltp1基因的上游同源臂片段；以红色红曲霉CICC41233总DNA为模板，以序列如SEQ ID No:11、SEQ ID No:12所示的一对引物执行PCR扩增，得到糖转运蛋白gltp1基因的下游同源臂片段；将所述上游同源臂片段和所述下游同源臂片段分别连接至所述载体pHph0380上，即得到双元质粒敲除载体pHph0380‑GLTP；4)制备感受态的根癌农杆菌EHA105，通过液氮冻融法将所述双元质粒敲除载体pHph0380‑GLTP导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒敲除载体pHph0380‑GLTP的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉CICC41233中，筛选阳性克隆，即得到所述高产菌株。