[发明专利]一种抗PEDV N蛋白的VHH噬菌体展示文库的构建方法及用途

摘要

本发明公开了一种抗猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白N的VHH噬菌体展示文库的构建方法及用途，构架方法包括以下步骤：免疫后的双峰驼分离外周血淋巴细胞、淋巴细胞总RNA的提取及反转录获得cDNA，设计两对PCR扩增引物，获得目的片段，将获得的目的片段与噬菌粒载体pCANTAB‑5E连接，将连接产物转化入TG1感受态细胞中并收获噬菌体抗体文库；成功构建抗猪流性腹泻病毒N蛋白的VHH噬菌体展示文库；计算文库库容量及文库的多样性；对所构建的文库进行质量评价。本发明建立的文库库容量大，多样性丰富等特点，对于建立猪流行性腹泻病毒的临床诊断方法，研究病毒的感染机理奠定了基础。

主权项

1.一种抗猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白N的VHH噬菌体展示文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外周血淋巴细胞的分离；利用PEDVN蛋白免疫双峰驼，采集抗凝血，分离获得外周血淋巴细胞，备用；(2)淋巴细胞总RNA的提取取步骤(1)中获得的外周血淋巴细胞，提取总RNA；(3)全基因cDNA的合成以步骤(2)提取的淋巴细胞总RNA为模板，进行反转录合成cDNA；(4)第一轮PCR扩增以步骤(3)合成的cDNA为模板，用引物CALL001和CALL002进行第一轮PCR扩增，扩增产物进行核酸电泳，收集纯化目的条带，备用；(5)第二轮PCR扩增以第一轮扩增产物为模板，用引物VHH‑FOR和VHH‑REV进行第二轮PCR扩增，扩增产物进行核酸电泳，收集纯化目的条带，备用；(6)VHH噬菌体展示文库的构建和收获将第二轮扩增产物和噬菌体展示载体pCANTAB‑5E双酶切后，进行连接，将50μl的连接产物加入600μl制备的TG1感受态细胞进行电转化，将转化的菌液均匀涂布于LB/AMP‑GLU平板，37℃培养6‑10h，向每个培养平皿内加入LB/AMP‑GLU培养基，用细胞刮刀收集菌苔，加入50％甘油，混匀分装，保存；(7)计算文库库容量和测定多样性取转化产物梯度稀释后涂布于LB/AMP‑GLU平板，37℃培养，计数平板上的菌落，计算转化子数量；随机挑取若干个单菌落进行菌液PCR鉴定，阳性克隆送测后，将测序结果进行序列比对，鉴定文库多样性。