[发明专利]一种混合干细胞治疗骨性关节炎的填充剂制备方法

摘要

本发明公开了一种混合干细胞治疗骨性关节炎的填充剂制备方法，包括脂肪组织采集并制备、收集脐血并采集细胞组织、脂肪干细胞分离与培养、脐带间充质干细胞分离与培养、细胞混合并诱导生成软骨细胞、加入生理盐水稀释、制备并添加富血小板血浆和制得填充剂。本发明的有益效果是：脂肪干细胞与脐带间充质干细胞培养所使用的培养箱温度设为37℃，且内部充有含量为5%的CO2气体，满足干细胞生长繁殖所需成分，在混合细胞溶液内添加磁性纳米微球，并在37℃恒温下通过超声波辅助细胞分散，进一步的提高诱导分化的过程，提高诱导分化的软骨细胞的数量和质量，混合细胞的脂肪干细胞与脐带间充质干细胞的含量比为2:1，更有利于软骨细胞的诱导。

主权项

1.一种混合干细胞治疗骨性关节炎的填充剂制备方法，其特征在于：包括以下步骤步骤A，脂肪组织采集并制备，筛选体检合格的供者，采用负压强度为300mmHg的水动力吸脂技术，供者局部麻醉后，在吸脂处开刀口并注入膨胀液，并在水动力的推动下，进行低负压吸脂，将脂肪组织吸入接收器，并进行冷冻保存，并将获取的脂肪静置处理，使膨胀液和筛分后的脂肪根据其比重不同自然分离，通过筛分网得到脂肪组织，并通过注射器将脂肪组织吸入注射器，得到小块脂肪组织微粒；步骤B，收集脐血并采集细胞组织，将无菌条件下取得的足月妊娠分娩胎儿脐带,用PBS洗3次,去掉残留的血细胞，并剪成片段，取出其中的凝胶状组织；步骤C，脂肪干细胞分离与培养，从组织中分离出脂肪干细胞，经贴壁筛选法纯化细胞、并采用无血清培养基进行体外培养扩增；步骤D，脐带间充质干细胞分离与培养，从组织中分离出脐带间充质干细胞，经贴壁筛选法纯化细胞、并采用无血清培养基进行体外培养扩增；步骤E，细胞混合并诱导生成软骨细胞，将培养后的脂肪干细胞和脐带间充质干细胞倒入培养瓶，并以细胞浓度5×105细胞/ml种于24孔板中，贴壁后24小时后用骨诱导液进行诱导，每3天换液一次，共诱导2周；步骤F，加入生理盐水稀释，诱导生成得软骨细胞移至离心管内，以离心得到上清液和下层细胞，弃上清液，并将下层细胞分装在多个培养瓶，依次添加生理盐水，进行稀释；步骤G，制备并添加富血小板血浆，静脉抽取全血，第一次离心以1600r/min离心10min，丢弃红细胞层；第二次离心以5000r/min离心5min，离心后吸弃部分血浆，用余下的1ml左右血浆重悬沉淀，得到富血小板血浆，并加入到稀释后得软骨细胞溶液内；步骤H，制得填充剂，依次添加乳化剂以及稳定剂，搅拌均匀，同时在搅拌过程中，加入pH调节剂至PH为7.2‑7.5，即得混合干细胞填充剂。