[发明专利]一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法

摘要

本发明公开了一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法，该方法包括以下步骤：S1菌株活化及扩大培养；S2固定化细胞制备；S3固定化细胞通电培养；S4发酵产酶培养；S5酶制剂分离纯化；S6循环利用。本发明利用固定化细胞技术将黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌共同固定在载体颗粒中，进行混合发酵来生产饲用酶制剂，各菌株之间互利共生，产出的酶种类丰富，与单独发酵生产各酶种，然后再复配相比，能简化生产工艺，缩短生产周期，大大提高生产效率。制备的固定化细胞颗粒稳定性好，易于分离回收，可循环利用产酶，大大降低生产成本，在饲用酶制剂生产领域具有很好的应用前景。

主权项

1.一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：S1菌株活化及扩大培养1）黑曲霉和康氏木霉：取黑曲霉和康氏木霉的保藏菌株，分别接种于PDA培养基平板上，30℃培养3‑5d，以长满孢子为准；将孢子用无菌生理盐水洗下，制备成浓度约为1×107个/ml的孢子悬液，将孢子悬液以5%的接种量接入PDB培养基中，在30℃、150rpm的旋转摇床上培养24‑30h，分别获得这两种菌的菌悬液；2）枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌：取枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的保藏菌株，分别接种于LB固体培养基斜面上，35℃培养18‑24h，取3环斜面菌种，接入LB液体培养基中，在35℃、180rpm的旋转上摇床培养18‑24h，分别获得这两种菌的菌悬液；S2固定化细胞制备称取适量的海藻酸钠加入无菌水中，加热融化制成浓度为6%的海藻酸钠溶液，待冷却到30℃左右时，将黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的混合菌悬液，与海藻酸钠溶液等体积混合均匀，用8号注射针头滴入0.05mol/L的CaCl2溶液中，制成直径约 2mm的固定化细胞颗粒，洗涤后备用；S3固定化细胞通电培养将制备好的固定化细胞颗粒加到装有液体培养基的三角瓶中，在温度31‑33℃、转速145‑155rpm的条件下培养24h，在培养的同时间歇性施加直流电场，进行刺激处理；S4发酵产酶培养将产酶培养基装入发酵罐中，装液量为发酵罐容量的60%左右，灭菌后接入通电培养后的固定化细胞颗粒进行发酵产酶培养，培养期间温度控制在31‑33℃，转速控制在175‑185rpm，通气量控制在1.2‑1.4V/V/M，共培养4‑6d；S5酶制剂分离纯化培养结束后将发酵液过滤，分离出固定化细胞颗粒和滤液，滤液进行超滤膜浓缩得到浓缩酶液，向浓缩酶液中加入10%体积的稻壳粉作为载体，充分搅拌混匀，然后进行喷雾干燥制成饲用酶制剂产品；S6循环利用将分离出的固定化细胞颗粒洗净后回收，接种到新鲜产酶培养基中，按照步骤S4所述方法再次进行发酵产酶培养；当固定化细胞产酶能力衰减50%时，进行恢复培养。