[发明专利]一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法

摘要

一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法，属于兽用生物制品技术领域。包括以下步骤：PCV2Cap基因的人工合成；含有PCV2Cap的昆虫表达载体的构建；含有昆虫表达质粒pFastBac^TM1‑PCV2Cap菌株的获得；含有重组杆状病毒表达质粒Bacmid‑PCV2Cap菌株的获得；重组杆状病毒表达质粒Bacmid‑PCV2Cap的获得；PCV2Cap重组AcNPVs的获得；PCV2型Cap蛋白的表达。通过本发明的方法能够构建出高效表达猪圆环病毒2型主要免疫原性蛋白Cap的真核表达载体，该真核表达载体能够大量表达Cap蛋白，可用于生产安全、有效的重组杆状病毒疫苗。

主权项

1.一种PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（1）PCV2Cap基因的人工合成根据GenBank：ADK34040.1 PCV2Cap蛋白序列优化设计得到其核苷酸序列和翻译蛋白的氨基酸序列；（2）含有PCV2Cap的昆虫表达载体的构建通过步骤（1）得到的密码子进行PCR扩增得到目的基因，将目的基因通过限制性内切酶位点BamHⅠ和SpeⅠ连接到昆虫表达载体pFastBac^TM1中，得到昆虫表达质粒pFastBac^TM1‑PCV2Cap；（3）含有昆虫表达质粒pFastBac^TM1‑PCV2Cap菌株的获得将昆虫表达质粒pFastBac^TM1‑PCV2Cap通过热激转化方法转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，然后通过氨苄青霉素抗性筛选，抽提质粒，双酶切及测序鉴定，得到阳性克隆菌株；（4）含有重组杆状病毒表达质粒Bacmid‑PCV2Cap菌株的获得将含有昆虫表达质粒pFastBac^TM1‑PCV2Cap菌株经扩增后，用试剂盒抽提方法得到质粒pFastBac^TM1‑PCV2Cap，该质粒通过热激转化方法转化到大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，质粒pFastBac^TM1‑PCV2Cap与Bacmid通过TN7转座子实现基因重组得到Bacmid‑PCV2Cap，利用含庆大霉素、四环素和卡那霉素的抗性蓝白斑筛选方法及PCR、测序鉴定，得到阳性克隆菌株；（5）重组杆状病毒表达质粒Bacmid‑PCV2Cap的获得挑取步骤（4）中阳性白色克隆菌株于抗性培养基中扩增，利用质粒大抽方法得到重组杆状病毒表达质粒Bacmid‑PCV2Cap；（6）PCV2Cap重组AcNPVs的获得将重组杆状病毒质粒Bacmid‑PCV2Cap通过FuGENE®6 Transfection Reagent试剂转染昆虫细胞SF9，培养3～5天待大部分细胞出现明显病变后收获培养上清，即为PCV2型Cap蛋白重组AcNPVs；（7）PCV2型Cap蛋白的表达将步骤（6）得到的Cap蛋白重组AcNPVs感染High Five细胞，得到大量表达Cap蛋白。