[发明专利]一种牛皮文物的高灵敏度检测方法

摘要

本发明涉及文物检测领域，公开了一种牛皮文物的高灵敏度检测方法，本发明方法先制备纯净的牛胶原蛋白粉末，同时提取文物样中的牛胶原蛋白；在NHS/EDC溶液的作用下利用层层自组装的方法在清理干净的玻碳电极表面依次修饰金纳米颗粒，中空结构的聚丙烯酸‑多巴胺复合物，聚甲基丙烯酸甲酯‑马来酸酐/1‑十八碳烯交替共聚物球形纳米珠，兔抗牛胶原蛋白多克隆抗体；利用修饰后的电极分别对牛胶原蛋白溶液和文物样溶液进行检测。本发明公开的方法，灵敏度高，检测下限低，重现性好，可对牛皮文物进行超灵敏检测。

主权项

1.一种牛皮文物的高灵敏度检测方法，其特征在于包括以下步骤：A）取健康成年黄牛部分牛皮，剪成小块，用碳酸钠水溶液于恒温箱中浸泡脱脂；取出经脱脂后的牛皮，脱脂后以每1g牛皮与14‑16 mL质量分数4‑6%氯化钠水溶液混合，室温缓慢搅拌10‑15 h除去盐溶性非胶原成分，最后用蒸馏水洗净沥干；B）将沥干后的牛皮置于容器中，按2000‑4000 U/g牛皮的量加入胃蛋白酶，然后按1g牛皮加入28‑32 mL的0.4‑0.6 mol/L乙酸，于35‑39 ℃恒温箱中进行酶解反应7‑9 h；酶解结束后，过滤，收集滤液，加入氯化钠盐析，氯化钠浓度为3‑5 mol/L，盐析后于离心处理，沉淀以0.4‑0.6 mol/L的乙酸溶解装入截留量为10000的透析袋中透析；最后取透析袋中的胶原蛋白溶液，冷冻干燥，研磨，得到牛胶原蛋白，备用；C）取一根玻碳电极，将去除污渍的玻碳电极在麂皮上依次用1.0μm、0.3μm、0.05 μm的氧化铝悬浮液中进行8字形打磨；接下来依次在无水乙醇和蒸馏水中超声洗涤；D）将洗净的玻碳电极浸泡在0.4‑0.6M的稀硫酸溶液中，在电化学工作站上利用循环伏安法循环活化35‑45周，循环伏安法的扫描范围为‑0.4V‑1.6V,扫描速率为0.08‑0.12V/s；E）配制得到PBS 7.4溶液，称取 K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]、KCl，加入PBS 7.4溶液，得到[Fe(CN)6]3‑/4‑浓度为4.5‑5.5 mM的铁氰化钾溶液；F）分别配制十六烷基三甲基溴化铵溶液、HAuCl4溶液和NaBH4溶液；将十六烷基三甲基溴化铵溶液添加于离心管中，在震荡作用下向其中加入HAuCl4溶液；再在震荡作用下，快速加入NaBH4溶液，剧烈震荡，静置，得到金纳米颗粒溶液；G）按体积比50‑70:80‑100:8‑12将0.15‑0.25 mg/mL的聚丙烯酸溶液、1.5‑2.5 mol/L的氨水和水混合，超声震荡，然后加入异丙醇，搅拌均匀，静置后1‑5℃保存；H）按体积比5‑7：8‑12：8‑12将步骤G）所得溶液、水，和异丙醇混合，随后加入多巴胺溶液，静置，得到中空结构的聚丙烯酸‑多巴胺复合物溶液；I）称取质量比为110‑130：70‑90的聚甲基丙烯酸甲酯和马来酸酐/1‑十八碳烯交替共聚物，加入三氯甲烷和十二烷基磺酸钠溶液，所得混合液超声震荡，离心，除去上清液，剩余产物用水洗涤多次，得到球形纳米珠，最后加入三氯甲烷中制得溶液，备用；J）取步骤D）处理后的玻碳电极，滴加35‑45 μL步骤F）中所得金纳米颗粒溶液于玻碳电极表面，室温干燥后，将电极浸泡0.2‑0.3M的巯基丙酸中5‑7h，然后彻底洗涤，将玻碳电极在NHS/EDC溶液浸泡中0.5‑1.5h；然后将玻碳电极洗涤后在其表面滴加25‑35 μL步骤H）所得溶液，室温干燥后洗涤，将玻碳电极在NHS/EDC溶液中浸泡20‑40min；彻底洗涤后在玻碳电极表面继续滴加25‑35μL步骤I）所得溶液，室温干燥，在NHS/EDC溶液中浸泡20‑40min；最后在玻碳电极表面滴加8‑12 μL兔抗牛胶原蛋白多克隆抗体，35‑39℃孵育0.5‑1.5h；K）用步骤B）中所得的牛胶原蛋白配制不同浓度的溶液，滴加15‑25 μL于步骤J）处理完的玻碳电极表面，35‑39℃孵育0.5‑1.5h，洗涤后在电化学工作站上用差分脉冲伏安法扫描测试，扫描范围为‑0.2V‑0.6V；L）称取文物样，用步骤B）中所述乙酸溶解，按步骤K）所用方法测试。