[发明专利]一种高产黄酮的高山火绒草愈伤组织诱导和规模化悬浮培养方法

摘要

本发明公开了一种高产黄酮的高山火绒草愈伤组织诱导和反应器悬浮培养方法。本发明主要针对现有技术的技术缺陷，提供一种可稳定获得高山火绒草高产黄酮的愈伤组织并进行反应器规模化培养的方法，解决当前尚无高黄酮含量的高山火绒草细胞系的问题。本发明通过对培养基中基础元素和激素进行大量筛选比较和其它实验条件摸索，建立了一种高山火绒草愈伤诱导方法，以无菌苗的茎、叶片等诱导愈伤组织，并建立了可培养高产黄酮类化合物的高山火绒草细胞系的组织培养方案，并能使用一次性生物反应器逐级放大，量产高产黄酮的高山火绒草细胞。

主权项

1.一种高产黄酮的高山火绒草愈伤组织诱导和反应器悬浮培养方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）高山火绒草种子消毒：将高山火绒草种子用自来水洗去尘土后，75%乙醇消毒30‑60 s，4%次氯酸钠溶液消毒8‑10 min，无菌水洗涤4次，置于基础培养基BM上，20‑25℃培养，光照强度500‑1000 lux；7‑21天即可萌发；所述的基础培养基BM指的是：1/2MS或MS+ 30 g/L蔗糖，琼脂0.7‑1.0%，pH 5.8‑6.0；（2）高山火绒草愈伤组织诱导：取无菌苗的叶片（或茎）分割为边长0.5‑1 cm方片或茎段，置于愈伤诱导培养基CIM，20‑25 ℃培养，光照强度＜1000 lux，14‑21 d即在切口边缘形成黄色疏松的愈伤组织，将愈伤组织分成约0.5 cm小块，置于愈伤继代培养基CM1，20‑25 ℃培养，光照强度＜1000 lux，每10‑15 d继代一次；所述的愈伤诱导培养基CIM指的是：B5 + 2‑4 mg/L 2,4‑D + 30 g/L蔗糖 + 0.1 mg/L L‑谷氨酰胺 + 0.2 mg/L 水解乳蛋白或B5 + 2‑4 mg/L 2,4‑D + 0.1‑0.5 mg/L 6‑BA + 30g/L蔗糖 + 0.1 mg/L L‑谷氨酰胺 + 0.2 mg/L水解乳蛋白，琼脂0.7‑1.0%，pH 5.8‑6.0；所述的愈伤继代培养基CM1指的是：B5 + 1‑2.5 mg/L 2,4‑D + 30 g/L蔗糖 + 0.1 mg/L L‑谷氨酰胺 + 0.2 mg/L 水解乳蛋白，琼脂0.7‑1.0%，pH 5.8‑6.0；（3）高山火绒草愈伤组织悬浮培养：选取质地疏松、颜色浅黄色至黄色、生长速度快的高山火绒草愈伤组织，按1 g/10 mL比例接入悬浮培养基CM2，置于摇床100‑115 rpm培养，温度保持20‑25 ℃，按5‑15 g/100 mL比例（湿重）每7‑10 d继代一次；生长速度2‑3倍/7 d；所述的悬浮培养基CM2指的是B5 + 1‑2 mg/L 2,4‑D + 30 g/L蔗糖 + 0.1 mg/L L‑谷氨酰胺 + 0.2 mg/L 水解乳蛋白或B5 + 1‑2 mg/L 2,4‑D +6‑BA 0.1‑0.2 mg/L + 30 g/L蔗糖 + 0.1 mg/L L‑谷氨酰胺 + 0.2 mg/L 水解乳蛋白，pH 5.8‑6.0；（4）高山火绒草愈伤组织的一次性生物反应器培养：选取状态一致的已培养7 d的悬浮培养材料，向5 L一次性生物反应器中接入1500‑2500 mL培养物和除菌处理的2500‑3500 mL 悬浮培养基CM2使终体积为5000 mL，振频为9.5次/min，通空气为0.1 m³/h，培养7 d，继代时，将培养物接入新的一次性生物反应器，加入2‑4倍体积的悬浮培养基CM2，振荡并通气培养，振荡频率范围为2‑15次/min，通气量为0.05‑0.3 m³/h，培养过程中反应器的振频为5‑20次/min。