[发明专利]一种大量提取转化粪便DNA的方法

摘要

本发明公开了一种大量提取转化粪便DNA的方法。首先将1～5g粪便收集到含保护液管中，加入裂解液充分裂解，再除去抑制剂，用有机溶剂沉淀核酸，通过重悬沉淀获得核酸，用于核酸提取或核酸转化，通过一系列结合洗涤步骤，最后洗脱得到粪便DNA。本发明包含粪便DNA的提取、转化和提取转化合并的方法。具有成本低、利用率高、重复性好、简单快速的特点，能得到大量粪便DNA或转化后的粪便DNA，为转化或下游的检测提供了更多可能性。

主权项

1.一种大量提取粪便DNA的方法，包括以下步骤：1)取5～35mL Buffer SPB至离心管中，所述Buffer SPB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、50～500mM NaCl、10～70％无水乙醇，再取1～5g粪便样本至管中，充分振荡混匀；2)先加入50～1000μL Buffer SLS，所述Buffer SLS包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、10～20％SDS，颠倒混匀，再加入50～500μL蛋白酶K，颠倒混匀后置恒温水浴锅56～75℃水浴5～30min；3)将离心管转至室温水浴1～5min，8000～12000g离心1～3min；4)取2～6mL上清于新的离心管中，加入1～2mL Buffer SDL，所述Buffer SDL包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、0.5～5％PVP10和0.5～3.5M醋酸钠，上下颠倒混匀，8000～12000g离心1～3min；5)取全部上清于新的离心管中，再加2～5mL有机溶剂，上下颠倒混匀，10000～14000g离心5～15min，弃上清；6)往离心管加入100～800μL Buffer DTE，所述Buffer DTE包括10～20mM Tris，5～10mM的EDTA，涡旋混匀至沉淀散开；7)10000～14000g离心1～5min，吸取全部液体至离心管；8)加入200～800μL Buffer DBB和300～700μL无水乙醇，所述Buffer DBB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris及4～6M胍盐，胍盐包括异硫氰酸胍或盐酸胍中的至少一种，充分振荡混匀；9)将混合液体加到纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；10)将剩余液体全部转移至纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；11)加入500～750μL Buffer DW1于纯化柱中，所述Buffer DW1包括150～400mM Tris，40～100mM的EDTA，2～5M异硫氰酸胍以及40～70％乙醇，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；12)加入500～750μL Buffer DW2于纯化柱中，所述Buffer DW2包括300～700mM Tris，0.8～1.2M的NaCl以及70～90％乙醇，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；13)换用新的收集管，10000～14000g离心1～5min；14)丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；15)滴加30～200μL Buffer DTE于纯化柱膜上，所述Buffer DTE包括10～20mM Tris，5～10mM EDTA，50～70℃孵育1～5min；16)10000～14000g离心1～5min，得到粪便DNA。