[发明专利]一种高通量三维细胞小球培养和原位药敏测试方法

摘要

本发明公开了一种高通量三维细胞小球培养和原位药敏测试方法，属于生物技术领域。本发明第一步在超疏水微坑阵列芯片上形成液滴阵列；第二步，在超疏水微坑阵列芯片上形成三维细胞小球阵列；第三步，在超疏水微坑阵列芯片上加入褐藻胶，将细胞小球固定在微坑中；第四步，超疏水微坑阵列芯片上原位药敏实验。本发明利用自主搭建的加湿和对准装置可以简单高效的实现给芯片每个微坑同时加样；利用悬滴培养及补液操作简便高效的实现了高通量三维小细胞球微阵列的构建；在芯片上建立了检测细胞活性的方法；利用自主建立的芯片上细胞活性检测方法实现了芯片上原位药敏测试，避免了细胞小球的转移操作以及由此引起的细胞小球的损失和破坏。

主权项

1.一种高通量三维细胞小球培养和原位药敏测试方法，其特征在于：分为以下步骤，第一步，在超疏水微坑阵列芯片上形成液滴阵列；(1.1)超疏水微坑芯片消毒；(1.2)液滴微阵列构建：用移液管吸取12mL PBS溶液，悬于超疏水微坑芯片微坑上方10cm处，逐滴滴下，用显微镜在超疏水微坑芯片上逐孔扫描，确保所有微坑中均有液体进入，在微坑中形成互相独立的液滴；第二步，在超疏水微坑阵列芯片上形成三维细胞小球阵列；具体如下：(2.1)细胞培养：选用HCC827细胞作为肺癌细胞的代表，肺癌细胞培养基采用1640培养基，向其中加入体积比10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素,2‑3天传代一次；(2.2)补液用薄层超疏水玻片准备；(2.3)喷样形成培养基溶液点阵；(2.4)细胞微阵列构建：胰酶消化肺癌细胞2‑3min，抽走胰酶，加入6‑7mL步骤(2.1)中的肺癌细胞培养基，用1mL移液枪多次吹打形成充分打散的肺癌细胞悬液；用血球计数板统计肺癌细胞浓度后，稀释肺癌细胞悬液到所需浓度，再将PBS溶液抽走，迅速向超疏水微坑芯片培养皿中加入12mL稀释好的肺癌细胞悬液，使超疏水微坑芯片浸没；静置沉降5min抽走多余细胞溶液，即形成细胞微阵列；(2.5)补液准备：首先封闭整个加湿装置，打开加湿器调至加湿最大，增加加湿装置内相对湿度至90％以上，同时打开紫外灭菌装置开始对整个加湿装置内部灭菌，30min后关掉加湿器及紫外灭菌装置，打开风扇吹散多余雾气，10min后关闭风扇；将超疏水微坑阵列芯片和喷样玻片转移至加湿装置内准备对准；(2.6)对准补液：先将超疏水微坑阵列芯片置于对准装置的置物台上，抽走浸没超疏水微坑阵列芯片的多余的细胞溶液，使其形成液滴阵列，取出喷样玻片，擦干背面水分后倒吸在对准装置的吸头上，逐步降低吸头，使喷样玻片和超疏水微坑阵列芯片逐渐靠近，利用CCD成像系统观察喷样点阵和液滴点阵，调整对准装置，将两个液滴点阵完全对准；关闭吸头，将喷样玻片落下，喷样液滴阵列与超疏水微坑阵列芯片微坑内的液滴阵列接触，即完成对准补液，再将喷样玻片缓缓提起；(2.7)悬滴培养形成三维细胞小球：迅速将超疏水微坑阵列芯片倒扣，放置在一个加有PBS溶液的10cm培养皿中；然后将其放入37℃，CO2培养箱中培养24小时h，使细胞在液滴顶部聚集，形成三维细胞小球；第三步，在超疏水微坑阵列芯片上加入褐藻胶，将细胞小球固定在微坑中；(3.1)观察记录细胞小球状态：将悬滴培养24h后的超疏水微坑阵列芯片正置于显微镜下，观察并拍照记录芯片中三维细胞小球生成情况；(3.2)形成褐藻胶：向已形成三维细胞小球微阵列的芯片中，先加入2％wt海藻酸钠水溶液，再加入2％wt氯化钙水溶液，氯化钙溶液与海藻酸钠溶液按体积比1:1混合后，会自发形成褐藻胶，将小球固定于微坑中；(3.3)培养细胞小球：用肺癌细胞培养基浸没芯片，置换掉多余的氯化钙溶液，浸没10min后，抽走多余的肺癌细胞培养基，使芯片恢复液滴状态，放入37℃，CO2培养箱中继续培养24小时；第四步，超疏水微坑阵列芯片上原位药敏实验；(4.1)加药前alamarBlue检测细胞活性：肺癌细胞培养基与alamarBlue试剂按体积比10:1的比例混合制成工作液，用工作液浸没已经形成细胞小球的超疏水微坑阵列芯片，静置10min，抽走多余工作液，使芯片恢复液滴阵列状态；将芯片放入暗盒中，避光孵育30min；利用荧光显微镜扫描整张芯片，获得芯片上所有微坑的红色荧光照片，分析得到每个微坑的荧光值；(4.2)药物孵育：荧光显微镜拍照记录后，用肺癌细胞培养基浸没芯片10min，洗去残留的alamarBlue；将芯片放入湿箱，抽走肺癌细胞培养基，使芯片恢复液滴状态；利用点样仪将顺铂药物按照0，0.4，4，40，400，4000μM六个浓度梯度点在玻片上，每个梯度重复24个点；利用补液操作，将药物对准加入芯片中，将芯片放入37℃，CO2培养箱，孵育24h；(4.3)加药后alamarBlue检测细胞活性：用肺癌细胞培养基浸没芯片，得到加药后芯片红色荧光扫描图；(4.4)图像处理：利用Image J软件分别分析两种芯片加药前后两张荧光图，计算两张图中相对应的每个微坑红色荧光强度，计算加药后每个微坑红色荧光强度和加药前对应微坑红色荧光强度的比值作为细胞加药后存活率的表征；(4.5)数据统计与分析：统计不同药物浓度的各个微坑数据，计算平均值和平均标准偏差，以加药0μM的对照组的平均值为1做归一化处理，得到细胞存活率与药物浓度关系图。