[发明专利]一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A基因干扰载体的制备方法

摘要

本发明涉及降低肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A基因干扰载体的制备方法，有效解决肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A的干扰，达到治疗肝癌用药的问题。方法是，构建慢病毒MAT2A干扰载体，将慢病毒MAT2A干扰载体转染到含有慢病毒载体的293T细胞的培养基中，对重组慢病毒pLentiH1‑MAT2AshRNA包装，重组慢病毒pLentiH1‑MAT2AshRNA滴度测定，计算病毒滴度；pLentiH1‑MAT2AshRNA侵染猪肌内脂肪细胞的检测，干扰载体MAT2A‑shRNA2对猪肌内脂肪细胞分化脂质沉积的检测，脂滴聚积能力在sh‑MAT2A处理组中降低48‑52%。本发明方法易操作、灵敏，稳定可靠，能显著降低脂肪细胞中MAT2A mRNA和蛋白的表达水平，且脂肪细胞中脂质含量水平也明显下降，实现对猪肌内脂肪细胞脂质沉积的干扰作用。

主权项

1.一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A基因干扰载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）慢病毒MAT2A干扰载体的构建：根据GenBank中猪MAT2A基因序列，利用Invitrogen公司在线软件BLOCK‑iT^TM RNAi Designer分别筛选3条shRNA靶序列和无关对照序列，将合成的单链寡核苷酸退火形成双链，分别命名为MAT2A‑sh1、MAT2A‑sh2、MAT2A‑sh3、Sh‑scramble，与经过BamH I和Xho I (TaKaRa)双酶切后的pLenti‑H1载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆提取质粒，酶切鉴定正确后，进行测序鉴定，确保插入载体的目标序列与设计合成的靶基因序列一致，得慢病毒MAT2A干扰载体；（2）重组慢病毒pLentiH1‑MAT2AshRNA包装：将步骤（1）制备的慢病毒MAT2A干扰载体转染到含有慢病毒载体的293T细胞的培养基中，对重组慢病毒pLentiH1‑MAT2AshRNA包装，方法是：对细胞密度为85‑95%的293T细胞置入新鲜的培养基中2‑4h，以使细胞适应，所述的培养基为每100mL PBS缓冲液中含0.5g DMEM干粉、胎牛血清10 mL，0.22g NaHCO₃，0.26gHepes；然后进行转染，转染时，先配置两种液体：A液，为溶解有质粒的溶液，由步骤（1）制备的10μg慢病毒MAT2A干扰载体+7.5μgΔ8.9+5μgVSVG溶解在1.5 mL无血清无双抗DMEM培养基中，混匀，所述的无血清无双抗DMEM培养基为每100 mL PBS缓冲液中含0.4‑0.6g DMEM干粉，0.18‑0.26g NaHCO₃，0.2‑0.3gHepes，混匀制得；B液，为溶解有脂质体的溶液：由30‑40μl X‑tremeGENE HP DNA溶解在1‑2 mL无血清无双抗DMEM培养基中，混匀制得；将A液和B液，分别室温静置4‑6min，混合均匀，再室温静置18‑22min，均匀滴加到培养皿中，轻微震荡，放培养箱培养，20‑30h观察荧光蛋白表达情况，48h和72h时分别收集上清液；将收集的病毒上清液于1800‑2200rpm离心8‑12min去除细胞碎片，即得包装的重组慢病毒pLentiH1‑MAT2AshRNA上清液；（3）重组慢病毒pLentiH1‑MAT2AshRNA滴度测定：将步骤（2）制备的重组慢病毒pLentiH1‑MAT2AshRNA上清液过0.4‑0.5μm滤膜，用80000‑120000r·min^‑1离心25‑35min得到浓缩的病毒颗粒；按照8‑12倍体积比用水稀释病毒，以10^‑2～10^‑6浓度梯度分别感染293T细胞，每个梯度3个重复，35‑40℃、置于体积为5%的CO₂培养箱培养48h，统计绿色荧光表达情况，每孔统计5个视野下的荧光数，按公式：病毒滴度（pfu·mL‑1）=GFP阳性细胞数×病毒稀释倍数÷0.01 mL，计算病毒滴度；4）pLentiH1‑MAT2AshRNA侵染猪肌内脂肪细胞的检测：用pLentiH1‑MAT2A‑shRNA慢病毒分别侵染猪肌内脂肪细胞48h，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP的表达，当细胞中都有GFP表达时，分别收集脂肪细胞的RNA和蛋白，利用Realtime‑PCR和Westernblot检测MAT2A‑shRNA的干扰效率，与sh‑scramble阴性对照相比，在脂肪细胞中MAT2A‑shRNA1、MAT2A‑shRNA2、MAT2A‑shRNA3的mRNA干扰效率分别是45％、70％和55％，收集MAT2A‑shRNA2的干扰载体；5）干扰载体MAT2A‑shRNA2对猪肌内脂肪细胞分化脂质沉积的检测：pLentiH1‑MAT2A‑shRNA侵染猪肌内前体脂肪细胞48h后，分化培养基诱导成脂分化8天至成熟，油红O检测脂质积累情况，与sh‑scramble对照组相比，脂滴聚积能力在sh‑MAT2A处理组中显著降低，达48‑52%，即为慢病毒介导的MAT2A基因干扰显著抑制猪肌内脂肪细胞的脂质沉积的MAT2A基因干扰载体。