[发明专利]一种基于gp120/CCR5阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法

摘要

本发明建立了一种基于gp120/CCR5阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法：将红色荧光蛋白tagRFP偶联于gp120蛋白羧基末端(C端)，构建真核表达载体，并制备gp120‑tagRFP融合蛋白；将人源CD4蛋白基因构建在CMV启动子下；将人源CCR5基因构建在CMV启动子下游，将绿色荧光蛋白基因d2EGFP构建在NF‑κB RE‑TATA‑like人工复合调控元件的下游，两者构建于同一个慢病毒载体内；并建立新型的稳转细胞系CD4.CCR5.CCR5.NF‑κBR‑d2EGFP/Jurkat；以gp120‑tagRFP与细胞系的亲和进行荧光检测筛选阻断剂。本方法可精确反映抗CCR5药的效应，并可同时获得阻断功能与CC趋化因子/CCR5信号通路的生物学效应数据，构建了快速筛选抗CCR5药物和评估其生物学效应的实验模型。

主权项

1.一种基于gp120/CCR5阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：1)将第一荧光蛋白与HIV‑1的gp120蛋白羧基末端连接构建重组gp120‑第一荧光蛋白融合蛋白质粒；在第一荧光蛋白的C端连接6个组氨酸His标签；并转入细胞表达纯化，获得gp120‑第一荧光蛋白融合蛋白；2)将人全长CD4基因克隆到真核表达载体CMV启动子下，构建表达质粒CMV‑CD4；将人全长CCR5基因克隆到CMV启动子下，同时将第二荧光蛋白基因构建在核因子κ B应答元件NF‑κB RE和TATA‑like启动子人工复合调控元件的下游，两者构建于同一个慢病毒载体内，构建高表达CCR5和调控表达报告基因质粒CMV‑CCR5.NF‑κB RE‑TATA‑like‑第二荧光蛋白质粒；将CMV‑CCR5.NF‑κB RE‑TATA‑like‑第二荧光蛋白基因和CMV‑CD4基因共转染到Jurkat细胞，建立稳转细胞系；3)将CCR5拮抗剂包括趋化因子衍生物、非肽类小分子化合物、单克隆抗体、肽类化合物等新药与稳转细胞共孵育后再与gp120‑第一荧光蛋白融合蛋白一起共孵育；同时设立稳转细胞与gp120‑第一荧光蛋白融合蛋白直接共孵育的对照组；清洗非特异性结合；4)将稳转细胞与CC趋化因子试剂和上述3)筛到的具有gp120/CCR5阻断功能的CCR5拮抗剂共孵育为实验组；同时设立稳转细胞与CC趋化因子试剂共孵育为对照组，设立不做任何处理的稳转细胞为空白组；清洗非特异性结合；5)分别检测第一、第二荧光蛋白荧光值，并判断新药对gp120/CCR5阻断功能及对CC趋化因子/CCR5信号通路的影响。