[发明专利]一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法有效
| 申请号： | 201910002839.1 | 申请日： | 2019-01-02 |
| 公开（公告）号： | CN109777779B | 公开（公告）日： | 2019-10-08 |
| 发明（设计）人： | 余红兵;刘欣;韩翠芳 | 申请（专利权）人： | 广东医科大学 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/85;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 深圳智趣知识产权代理事务所(普通合伙) 44486 | 代理人： | 黄秋云 |
| 地址： | 523808 广东省东莞*** | 国省代码： | 广东;44 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | 本发明公开了一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法，具体为：先设计p73基因位点特异性sgRNA序列，克隆进质粒PX459；整合p73基因同源重组序列以及绿色荧光蛋白DNA片段(EGFP)，将上述质粒和整合片段共同电击转化大肠癌细胞系HCT116；通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系；筛选的EGFP表达细胞系通过PCR鉴定及免疫印迹验证阳性p73报告基因细胞系。该大肠癌细胞系p73基因和EGFP共同表达，其EGFP表达水平和p73基因具有高度一致性，故通过检测EGFP表达水平变化可以准确判断p73基因表达水平。本发明建立细胞系方法简单、易行、高效和精准定位基因位点。 | ||
| 搜索关键词： | 报告基因 大肠癌细胞系 基因位点 大肠癌 整合 质粒 单克隆细胞系 基因表达水平 基因同源重组 绿色荧光蛋白 单细胞筛选 高度一致性 流式细胞仪 电击转化 精准定位 免疫印迹 水平变化 基因 扩增 克隆 筛选 验证 细胞 检测 | ||
【主权项】：
1.一种建立大肠癌p73报告基因细胞系的方法，包括以下步骤：步骤1：p73基因下游位点特异性p73‑sgRNA序列设计及评估；步骤2：构建pX459/p73‑sgRNA质粒；步骤3：整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段；步骤4：将上述质粒pX459/p73‑sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段按1:1的比例共同电击转化大肠癌细胞系HCT116；步骤5：通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系；步骤6：筛选获得的EGFP表达的细胞系进一步通过基因组PCR及免疫印迹方法鉴定p73报告基因细胞系；其中，所述步骤1中，设计并筛选出p73‑sgRNA序列，所述p73‑sgRNA的序列如SEQ ID NO：1所示；所述步骤2中，构建pX459/p73‑sgRNA质粒的方法如下：根据所述p73‑sgRNA的序列，经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒pX459/p73‑sgRNA；步骤3中，整合p73基因的同源重组序列和EGFP片段的方法如下：根据p73基因的同源重组序列和EGFP序列，经生物公司合成后直接获得正确的整合片段L‑EGFP‑R；所述片段L‑EGFP‑R的序列如SEQ ID NO.2所示。
下载完整专利技术内容需要扣除积分，VIP会员可以免费下载。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于广东医科大学，未经广东医科大学许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/patent/201910002839.1/，转载请声明来源钻瓜专利网。
