[发明专利]一种SD大鼠皮层神经元培养方法

摘要

本发明提供了一种SD大鼠皮层神经元培养方法，本方法操作简单，具有较高的可重复性；通过使用专用神经元培养基，皮层神经元生产效果好，保证了皮层神经元的纯度。本发明能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的SD大鼠皮层神经元，便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究皮层神经元的生理功能。

主权项

1.一种SD大鼠皮层神经元培养方法，其特征在于，包括以下步骤：神经细胞专用培养基制备：超净工作台内取96ml Neurobasal A基础培养基于无菌、干净的瓶内，加入2ml B27、1ml青链霉素双抗、1ml谷氨酰胺，0.22um过滤器过滤后转移至新的瓶内，盖紧瓶盖；瓶子上标明培养基名称、配制日期、配制人后缠紧封口膜，4℃冰箱保存备用；SD大鼠皮层神经元细胞提取培养：步骤A：取刚出生1天的新生SD大鼠4只，体积百分比为75%的乙醇浸泡淹死；步骤B：取四个10cm培养皿，每个皿内加入约10ml解剖液；步骤C：将步骤A中得到的新生SD大鼠放入第一个培养皿中，让解剖液充分浸泡新生SD大鼠，将新生SD大鼠头部取下；步骤D：将步骤C中取下的头部转移到第二个盛有解剖液的培养皿内，除去头部皮肤；步骤E：将步骤D中除去头部皮肤的大鼠头部使用显微镊撕开颅骨，撕开颅骨后，用眼科镊固定住头部，用显微镊撕掉颅骨，暴露出整个大脑；步骤F：将步骤E中取得的大脑转移至第三个盛有解剖液的培养皿内，体式显微镜下找到脑膜，用显微弯镊固定住脑部，用显微直镊撕除脑膜；用显微剪轻轻剪下大脑皮层组织，取材厚度0.5mm，放入第四个盛有解剖液的培养皿内，转移至超净工作台内；步骤G：将取下来的大脑皮层组织在解剖液内剪成约0.5mm³大小，用巴氏吸管将组织块连同解剖液转移至15ml离心管内；1000rmp/min离心3min，弃上清；2ml 0.25%胰酶消化9分30秒，加入4ml DMEM/F12终止消化；巴氏吸管吹打20次，静置3min使未吹散的组织块沉降，吸取上层皮层神经元细胞悬液至新的15ml离心管内；重复此操作两次；1000rmp离心5min收集细胞，弃上清，用5ml DMEM/F12完全培养基重悬细胞；步骤H：在六孔板每个孔接种5X10⁵个细胞；接种细胞后培养箱内培养，4h时细胞开始贴壁；培养24h时细胞长出形态，但形态并未完全伸展；培养3d时细胞完全长出形态，呈网状生长；培养5d时培养完成。