[发明专利]一种利用改进的CRISPR-Cpf1进行基因装配的新方法

摘要

本发明公开了一种利用改进的CRISPR‑Cpf1进行基因装配的新方法，它是一种利用来自于Francisella tularemia noticed U112菌株(土拉弗朗西斯菌诺维达亚种U112，基因序列号：MF193599)的DNA基因编辑酶FnCpf1进行基因重组克隆的方法。本方法在不影响FnCpf1切割效率的前提下，将crRNA(规律成簇的间隔的短回文重复序列转录产生的RNA序列)的种子序列从文献报道的23个核苷酸缩短为18个。同时选用oligo(dN)6(寡核苷酸六聚体)作为切割靶位点产生的粘性末端，克服了FnCpf1酶切后末端不均一的问题，从而显著提高外源DNA片段的装配效率，DNA片段装配效率达到85％左右。所述基因编辑酶FnCpf1可以用AsCpf1和LbCpf1等其它核酸编辑酶Cpf1代替。

主权项

1.一种利用改进的CRISPR‑Cpf1进行基因装配的新方法，其特征在于步骤为：一、FnCpf1核酸编辑酶构建及表达与纯化1)FnCpf1表达载体的构建：按照T5核酸外切酶介导的克隆方法，对基因序列号为MF193599的核酸编程酶FnCpf1的基因片段和表达载体pET23a分别进行PCR扩增，产物经过琼脂糖凝胶检测并回收，回收后的基因片段和载体片段按照3:1的摩尔比混合，用T5核酸外切酶，然后进行大肠杆菌的常规转化培养，用碱裂解法抽提重组质粒pet23a‑FnCpf1进行琼脂糖凝胶电泳检测和测序鉴定；2)FnCpf1核酸编辑酶在大肠杆菌中的表达与纯化：将测序正确的重组子质粒pet23a‑FnCpf1转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株诱导表达培养，收集大肠杆菌菌体，超声破菌后离心，粗裂解物与亲和树脂充分混合，使目的蛋白结合到镍珠上，用咪唑缓冲液洗脱重组蛋白，用凝胶电泳检测。最后得到目标核酸编辑酶FnCp1；二、sgRNA(单链指导核糖核酸)的合成，先由上海生物工程公司合成两个正反引物A和B；引物A序列:5’‑attaatacgactcactatagggaatttctactgttgtagatcatatgcatcaccatcacccttta‑3’引物B序列:5’‑taaagggtgatggtgatgcatatgatctacaacagtagaaattccctatagtgagtcgtattaat‑3’然后采用引物退火‑聚合酶链式扩增的方式合成相应的双链DNA模板，随后用体外T₇转录试剂盒转录制备相应的gRNA(指导核糖核苷酸)，用无核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶I去除脱氧核糖核酸模板，得到产品为种子序列为18个核苷酸的sgRNA(单链指导核糖核酸)，名称命名为sgRNA‑18；三、进行目标质粒改造，选择质粒pUC57‑gfp(带绿色萤光标记蛋白)为供体载体，供体片段GFP两端分别含有核酸编辑酶FnCpf1的酶切位点，使用常规PCR方法设计引物对gfp片段进行扩增，从而在供体片段gfp的片段末端与FnCpf1核酸编辑酶的酶切位点之间添加6nt的oligo(dG)6(脱氧鸟嘌呤寡核苷酸六聚体)和6nt的oligo(dT)6(脱氧胸腺嘧啶寡核苷酸六聚体)，改造后质粒命名为pUC57‑gfp‑6a6g；同时选择质粒pET23a‑C2C1为受体载体，受体载体pET23a两端分别含有核酸编辑酶FnCpf1的酶切位点，使用常规PCR方法设计引物对受体载体pET23a进行扩增，从而在受体载体pET23a的载体末端与FnCpf1核酸编辑酶的酶切位点之间添加6nt的oligo(dC)6寡核苷酸(脱氧胞嘧啶寡核苷酸六聚体)和6nt的oligo(dA)6(脱氧胸腺嘧啶寡核苷酸六聚体)；以上均使用T5克隆方法得到重组受体质粒与载体质粒，该操作使得用核酸编辑酶FnCpf1对供体和受体质粒进行酶切后得到的供体DNA片段和载体骨架的粘性末端是互补的，改造后质粒命名为pET23a‑C2C1‑6a6g；四、将第一步纯化后的编程酶FnCpf1与第2步骤种子序列sgRNA‑18组成复合物，分别对供体质粒pUC57‑gfp‑6a6g和受体质粒pET23a‑C2C1‑6a6g在45℃酶切30分钟，反应缓冲液为50mM三羟甲基氨基甲烷‑盐酸，40mM氯化钠，随后在80℃，10分钟灭活酶；五、利用常规的琼脂凝胶电泳法，分别回收第4步反应后的供体DNA片段和载体骨架；六、将回收的gfp‑6a6g供体DNA片段与pET23a‑6a6g载体骨架按照摩尔比3：1混合，通过T₄ DNA连接酶在16℃连接4‑5小时，进行基因装配；七、连接后的产物转化大肠杆菌DH5α，进行表达培养；大肠杆菌DH5α感受态与连接物按照1：100的体积比混合，冰浴30分钟，42℃热激45秒，37℃复苏1小时，涂布相应抗性平板，37℃培养过夜，随机挑取单菌落进行重组子的鉴定，并送公司测序，重组子名称命名为pET23a‑gfp，对多次重复实验进行结果统计，重组率可达85±0.3％。