[发明专利]观察细胞迁移极化分子分布的方法

摘要

本发明提出了一种观察细胞迁移极化分子分布的方法，细胞可在特定趋化物的作用下定向运动，可用于对不同细胞在特定趋化物作用下的趋化运动观察，并基于此对细胞迁移极化中的特定子分布进行观察；另外，本发明中细胞迁移过程排除自身重力因素影响，可对细胞迁移极化过程及相关极化分子进行观察。

主权项

1.一种观察细胞迁移极化过程中分子分布的方法，其特征在于：所述观察细胞迁移极化过程中分子分布的装置，包括：在圆形培养皿2中装有3ml琼脂糖1，在琼脂糖中有两个圆孔3，4，即为细胞用孔和趋化物用孔，在连接圆孔3，4之间的区域为观察细胞迁移的区域5；所述的观察细胞迁移极化过程中分子分布装置的制备方法，包括：（1）玻璃组织培养片的准备：利用100%甲醇清洗玻片并晾干，将干燥后的玻片放置于培养皿中，加入10%的胎牛血清FBS并于室温静置30分钟；去除FBS，使用PBS洗涤两遍；（2）配置A液：在50ml离心管内依次加入RPMI1640培养液18ml、胎牛血清2ml、含钙镁的10*HBSS2ml、无菌双蒸水8ml，充分混匀，置于68℃水浴箱中，水浴35分钟；（3）配置B液：50ml离心管称取0.48g低熔点超纯去热源琼脂糖，加入10ml无菌双蒸水，涡旋振荡器上剧烈震荡15秒，充分混匀；（4）配置A, B混合液：使用微波炉加热至B液沸腾，将A液移至B液中，充分混匀A、B液；（5）制作琼脂糖凝胶：吸取AB混合液3ml加入至含步骤（1）所述玻片的培养皿中，室温冷却1小时，再放置于4冰箱中冷却1小时，即为琼脂糖凝胶；（6）制作细胞及趋化用孔：在培养皿的琼脂糖凝胶上制作孔间距为2.4mm，孔径大小为3.5mm的小孔，使用负压吸引器吸除小孔内的凝胶室温静置30分钟，再次使用负压吸引器吸除小孔内的液体；两个小孔，左侧为细胞用孔，右侧为趋化物用孔；所述观察方法包括：（1）向上述制备的观察细胞迁移极化过程中分子分布的装置中分别加入细胞、趋化物：在右侧趋化物用孔中加入10ul的趋化物，浓度为0.1‑1uM，左侧的细胞用孔中加入10ul的细胞悬液，细胞浓度为1*107个/ml；将培养皿置于孵育箱中培养2‑3小时；趋化物可在琼脂糖凝胶下扩散形成浓度梯度，细胞可在趋化物的作用下发生定向迁移；（2）固定：细胞迁移结束后，使用添加量为5ml/皿的预冷的1%的多聚甲醛固定细胞10分钟，轻轻的去除琼脂糖凝胶，使用5ml/皿的预冷的PBS洗涤细胞两次；（3）通透：观察细胞内的分子改变，需要使用预冷的通透液冰上通透细胞5分钟，而观察细胞表面分子则不需要进行细胞通透；（4）封闭：使用5ml/皿的1%BSA封闭液封闭细胞30分钟，移液器吸除封闭液，无需洗涤；（5）染色：培养皿中加入稀释好的一抗室温孵育1‑4小时，PBS洗2遍，接着加入稀释好的二抗室温孵育1小时，PBS 洗涤2遍；使用DAPI复染细胞核，PBS洗涤2遍；（6）封片观察：取出玻片，置于载玻片上，封片并使用激光共聚焦观察迁移极化细胞分子分布情况。