[发明专利]一种检测土壤中β-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法

摘要

本发明公开了一种检测土壤中β‑D‑葡萄糖苷酶活性的分析方法，属于酶活性检测技术领域。该装置包括如下步骤：酶活性＝[(RS‑BU)*(SA‑SC)/(QS‑SC)]‑(NC‑BU)]*b*2*3000/(0.3*W*200)，其中，SC为上清液+50μl的醋酸缓冲液所测荧光强度值，QS为上清液+50μl的标样液所测荧光强度值，SA为上清液+50μl的4‑甲基伞形酮‑β‑D‑葡萄糖苷底物溶液所测荧光强度值，BU为200μl的醋酸缓冲液+50μl醋酸缓冲液所测荧光强度值，RS为200μl的醋酸缓冲液+50μl的标准品溶液所测荧光强度值，NC为200μl的醋酸缓冲液+50μl的4‑甲基伞形酮‑β‑D‑葡萄糖苷底物溶液所测荧光强度值。本发明可以减小背景值，能排除样品与荧光基团互作的背景值，排除缓冲液对标准品的背景值，提高测量结果的准确性，样品及药品用量少。

主权项

1.一种检测土壤中β‑D‑葡萄糖苷酶活性的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：配制50mM醋酸缓冲液，取4.1g醋酸钠、161μl冰醋酸和无菌去离子水水定容至1000ml并调节PH至5.5；配制200μM的4‑甲基伞形酮‑β‑D‑葡萄糖苷底物溶液，称取6.762mg的4‑甲基伞形酮和30μl二甲基亚砜溶解溶解，加无菌去离子水稀释定容至100ml；配制10μM标准品溶液，称取1.762mg的4‑甲基伞形酮和30μl二甲基亚砜溶解，再定容至1000ml，制得10μM标准品溶液；将标准品溶液用蒸馏水分别稀释成浓度为0、0.025μM、0.05μM、0.125μM、0.25.0μM、0.5μM的标准溶液，制得标样液，分别用移液枪吸取50μl至96孔板中，后分别加入200μl醋酸缓冲液，再分别加入20μl的1M NaOH溶液，然后进行荧光检测，如此重复制作3条标准曲线；称取2份0.3g的土壤鲜样于5ml离心管中，其中1份用于烘干测土壤含水量W，另1份加入3mL醋酸缓冲液均质混匀，在涡旋仪上高速震荡5分钟，再4℃低温4000R离心5分钟；吸取3份容量为200μl的经离心后的土壤鲜样与醋酸缓冲液混合物的上清液至96黑孔板中，其中一份再加50μl醋酸缓冲液，一份加50μl的10μM的标样液，另一份加50μl的4‑甲基伞形酮‑β‑D‑葡萄糖苷底物溶液；在37℃培养2h后向黑孔板中每孔加入20μl的1M的NaOH溶液，终止反应；在荧光检测仪读板温度37℃、酶标板震荡时间1min、激发波长350nm、发射波长450nm的条件下，测定每孔的荧光强度值；以标样液浓度和测定的吸光值A制作标准曲线，得到斜率b；通过如下公式计算得酶活性：酶活性＝[(RS‑BU)*(SA‑SC)/(QS‑SC)]‑(NC‑BU)]*b*2*3000/(0.3*W*200)，其中，SC为上清液+50μl的醋酸缓冲液所测荧光强度值，QS为上清液+50μl的标样液所测荧光强度值，SA为上清液+50μl的4‑甲基伞形酮‑β‑D‑葡萄糖苷底物溶液所测荧光强度值，BU为200μl的醋酸缓冲液+50μl醋酸缓冲液所测荧光强度值，RS为200μl的醋酸缓冲液+50μl的标准品溶液所测荧光强度值，NC为200μl的醋酸缓冲液+50μl的4‑甲基伞形酮‑β‑D‑葡萄糖苷底物溶液所测荧光强度值。