[发明专利]基于蛋白质-无机杂化纳米花的乙酰胆碱检测试剂盒及其制备方法

摘要

一种基于蛋白质‑无机杂化纳米花的乙酰胆碱活性的定量检测试剂盒及其制备方法，属于生物传感器技术领域。该试剂盒负载蛋白质‑无机杂化纳米花、乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶以及显色剂。根据乙酰胆碱酯酶可以催化乙酰胆碱水解产生胆碱，胆碱被胆碱氧化酶进一步氧化产生过氧化氢，所形成的过氧化氢被羟基催化氧化产生羟基自由基进而使显色剂显色。本发明基于上述原理建立的试剂盒能够快速检测乙酰胆碱，为乙酰胆碱的识别提供了直接的定量工具其具有操作简便、灵敏度高、成本低廉等优势，为乙酰胆碱的活性的即时测试提供便携式的现场检测试剂盒将满足频繁筛查和诊断跟踪的需要。

主权项

1.一种基于蛋白质‑无机杂化纳米花BSA‑Cu₃(PO₄)₂·3H₂O的乙酰胆碱ACh活性检测试剂盒的制备方法，其步骤如下：(1)将Na₂HPO₄和NaH₂PO₄溶于PBS缓冲液，配制成pH值在6.5～7.0之间的PBS缓冲液溶液；将CuSO₄溶于水，配制150～250mmol L^‑1的CuSO₄水溶液；将20～30μL上述制备的pH值在6.5～7.0之间的PBS缓冲液溶液和10～30μL上述制备得到的CuSO₄水溶液混合后震荡1～3分钟，得到混合溶液；将0.8～1.2mg mL^‑1、80～120μL的牛血清白蛋白BSA水溶液加入到上述混合溶液中，静止12～18小时后离心3～5分钟；向所得沉淀中加入去离子水100～150μL，得到蛋白质‑无机杂化纳米花BSA‑Cu₃(PO₄)₂·3H₂O水溶液，最后将蛋白质‑无机杂化纳米花BSA‑Cu₃(PO₄)₂·3H₂O水溶液用去离子水稀释至BSA‑Cu₃(PO₄)₂·3H₂O浓度为4mg mL^‑1；(2)在100℃下，将18～24mg琼脂糖溶解在装有1.8～2.4mL水的离心管中；等反应体系温度降到50～60℃时，将步骤(1)制备的150～250μL、4mg mL^‑1蛋白质‑无机杂化纳米花BSA‑Cu₃(PO₄)₂·3H₂O水溶液和50～100μL、0.8～1mg mL^‑1的3,3’,5‑,5’‑四甲基联苯胺TMB水溶液的混合溶液加到上述离心管中，搅拌均匀，取出200μL溶液滴在另外一个离心管的盖子上；等温度降到室温，离心管盖子上的琼脂糖溶液凝固，随后在该离心管中加入40～60μL、1U mL^‑1的乙酰胆碱酯酶AChE水溶液和40～60μL、2U mL^‑1胆碱氧化酶CHO水溶液的混合溶液，得到基于蛋白质‑无机杂化纳米花BSA‑Cu₃(PO4)₂·3H₂O的乙酰胆碱ACh活性检测试剂盒。