[发明专利]一种香石竹叶片原生质体的制备方法

摘要

本发明属于植物组织和细胞培养技术领域，具体涉及一种香石竹叶片原生质体的制备方法。以香石竹组培苗为试验材料，建立了低速振荡酶解—沉降法纯化的高效的原生质体制备体系。本发明操作简便且可常年进行，经低速震荡酶解分离与密度梯度纯化后的原生质体产量高，可达183×105个/gFW，细胞完整率高，并保证活力在75％以上。本发明为利用香石竹叶片瞬时转化体系进行基因功能鉴定、亚细胞定位以及蛋白质互作等方面的研究奠定了基础。

主权项

1.一种香石竹叶片原生质体的制备方法，其特征包括以下步骤：(1)在天气晴朗、干燥的上午采集田间生长的香石竹植株的嫩芽，适当剪去叶片，先用洗衣粉水清洗，再用自来水在流水状态下冲洗；(2)在超净工作台上将步骤(1)处理的香石竹嫩芽，用2％的次氯酸钠溶液浸泡30min，浸泡期间适当摇晃，然后用无菌水清洗；再用浓度为75％的乙醇浸泡30s，最后用无菌水冲洗2‑3次；取出消过毒的嫩芽用无菌滤纸吸干；(3)将步骤(2)所得的香石竹嫩芽用解剖刀切去嫩芽下端2mm的茎段，将剩余部分作为外植体接种至初代培养基上，培养温度为25±1℃，相对湿度为50％‑60％，光照强度为2000‑3000lux，光照/黑暗周期为16h/8h，培养30d，得到初代组培苗；(4)用解剖刀切取初代组培苗上新长出的幼苗，将幼苗转移至继代培养基进行继代培养，培养温度为25±1℃，相对湿度为50％‑60％，光照强度为2000‑3000lux，光照/黑暗周期为16h/8h；继代培养30d；(5)取上步生长健康的中部叶片，弃去下部老化叶片及顶芽嫩叶，将叶片置于垫有用FM预处理培养基湿润的滤纸的培养皿中，在室温黑暗条件下处理48h；(6)将上步所得叶片置于干净的滤纸上吸干残余溶液，转移至垫有用CM预处理培养基湿润的滤纸的培养皿中，在4℃黑暗条件下处理24h；(7)将上步所得叶片逐一用解剖刀切成0.5‑1mm的条状，放入装有酶解液的锥形瓶中，使酶解液充分浸没叶片；(8)将上步所得酶解混合物置于定轨振荡器上，50r/min低速震荡酶解3‑4h；(9)用胶头滴管吸取上步所得酶解混合液，用套筒漏斗和200目尼龙网过滤，收集至10ml玻璃离心管中，于600r/min离心7min；(10)将上步所得离心产物弃去上清液，用原生质体重悬液MR重悬离心管下部绿色沉淀，液体体积标定至4ml，在600r/min下离心7min；(11)将上步所得离心产物弃去上清液，再次用MR重悬液重悬离心管下部绿色沉淀，液体体积标定至1ml，原生质体即制备完成。其中：步骤(3)中的初代培养基配制：MS基本培养基；3％蔗糖；0.75％琼脂；0.15mg/L塞苯隆(TDZ)，调培养基pH至5.8，121℃高压蒸汽灭菌30min；步骤(4)中继代培养基配制：MS基本培养基，3％蔗糖，0.75％琼脂，0.3mg/L萘乙酸(NAA)，调培养基pH至5.8，121℃高压蒸汽灭菌30min；步骤(5)中的FM预处理培养基的配制：NH₄NO₃ 80mg/L；CaCl₂·2H₂O 147mg/L；2‑(N‑吗啉代)乙烷磺酸(MES)3mM mg/L；调培养基pH至5.8；在121℃高压蒸汽中灭菌30min；步骤(6)中的CM预处理液的配制：KNO₃ 190mg/L；CaCl₂·2H₂O 44mg/L；MgSO₄·7H₂O 37mg/L；KH₂PO₄ 17mg/L；H₃BO₃ 0.62mg/L；KI 0.083mg/L；Na₂Mo₄·2H₂O 0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O 0.0025mg/L；MnSO₄·4H₂O 2.23mg/L；ZnSO₄·7H₂O 0.86mg/L；FeSO₄·7H₂O 2.79mg/L；Na₂EDTA 3.73mg/L；VB₁ 0.05mg/L；VB₆ 0.05mg/L；烟酸0.5mg/L；生物素0.005mg/L；甘氨酸0.2mg/L；叶酸0.05mg/L；水解酪蛋白100mg/L；萘乙酸(NAA)2.0mg/L；细胞分裂素(BA)1.0mg/L；肌醇10mg/L；2‑(N‑吗啉代)乙烷磺酸(MES)3mM mg/L；调培养基pH至5.8，121℃高压蒸汽灭菌30min；步骤(7)中酶解液1/10RA培养基的配制：1.5％纤维素酶(Cellulase R‑10)；0.2％果胶酶(Pectolyuse Y‑23，Japan Yukult)；2％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；2％牛血清白蛋白(BSA)；调酶解液pH至5.8，在超净工作台中上用0.22μm过滤器过滤灭菌，备用；步骤(7)中酶解液RA培养基的配制：NH₄Cl 267.5mg/L；KNO₃ 1900mg/L；CaCl₂·2H₂O 440mg/L；MgSO₄·7H₂O 370mg/L；KH₂PO₄ 170mg/L；H₃BO₃ 3.1mg/L；KI 0.42mg/L；Na₂Mo₄·2H₂O 0.13mg/L；ZnSO₄·7H₂O 4.6mg/L；CuSO₄·5H₂O 0.013mg/L；FeSO₄·7H₂O 13.9mg/L；Na₂EDTA 18.5mg/L；VB₁ 0.5mg/L；VB₆ 0.5mg/L；烟酸5.0mg/L；生物素0.05mg/L；甘氨酸2.0mg/L；叶酸0.5mg/L；水解酪蛋白100mg/L；调培养基pH至5.8；121℃高压蒸汽灭菌30min，‑20℃低温保存；步骤(10)MR重悬液的配制：NH₄NO₃ 1900mg/L；CaCl₂·2H₂O 440mg/L；MgSO₄·7H₂O 370mg/L；KH₂PO₄ 170mg/L；H₃BO₃ 3.1mg/L；KI 0.42mg/L；Na₂Mo₄·2H₂O 0.13mg/L；CoCl₂·6H₂O 0.013mg/L；MnSO₄·4H₂O 11.16mg/L；ZnSO₄·7H₂O 4.3mg/L；CuSO₄·5H₂O 0.013mg/L；FeSO₄·7H₂O 13.94mg/L；Na₂EDTA 18.64mg/L；VB₁ 0.5mg/L；VB₆ 0.5mg/L；烟酸5.0mg/L；生物素0.05mg/L；甘氨酸2.0mg/L；叶酸0.05mg/L；水解酪蛋白100mg/L；萘乙酸(NAA)2.0mg/L；细胞分裂素(BA)0.5mg/L；甘露醇0.5M mg/L；调MR重悬液pH至5.8；在121℃高压蒸汽灭菌30min,，4℃下保存。