[发明专利]一种毛细血管畸形相关多基因的捕获测序方法

摘要

本发明公开了一种毛细血管畸形相关多基因的捕获测序方法，该方法至少包括如下步骤：基因组DNA的提取和片段化，片段化DNA末端补平、接头连接、捕获前PCR、杂交捕获、捕获后PCR。本发明选取的与人毛细管畸形相关的多个基因，包括ACVRL1、AKT1、ENG、EPHB4、GNA11、GNAQ、KRAS、MAP2K1、NRAS、PIK3CA、PTEN、RASA1、SMAD4、TEK，通过将基因捕获技术与高通量测序技术相结合，从而检测靶基因的所有变异类型，如突变、缺失、插入、融合等。

主权项

1.一种毛细血管畸形相关多基因的捕获测序方法，其特征在于，包括如下步骤：S1 基因组DNA的提取和片段化1.1 准备试剂如下：QIAamp DNAMini试剂盒；1.2 基因组DNA的提取，用QIAamp DNAMini试剂盒对被检者进行组织提取，被检者组织的取材应取自表皮以下的真皮层，包含毛细血管为宜；1.3 基因组DNA片段化，使用Covaris仪器，并按推荐操作流程进行操作，目标片段大小为200‑300bp；S2 片段化DNA末端补平2.1 准备试剂如下：End prep mix4；2.2 配制反应体系：在PCR管中加入DNA和End prep mix4，配制完成后，涡旋并短暂离心；2.3 将配制完成的反应体系置于PCR仪上，启动反应程序；S3 接头连接3.1 准备试剂如下：Rapid Ligation Buffer2、Rapid DNA Ligase、DNA Adaptor X、高纯水、80%乙醇、AHTS DNA Clean Beads；3.2 配制反应体系：在PCR管中加入模板、Rapid Ligation Buffer2、Rapid DNA Ligase、DNA Adaptor X、高纯水，配制完成后，涡旋并短暂离心；3.3 将配制完成的反应体系置于PCR仪上，启动反应程序；3.4 连接产物纯化3.4.1 加80μL磁珠到上步产物中，轻轻吹打10次以保证整个体系均匀；室温孵育5分钟，使文库结合到磁珠上；3.4.2 离心管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体；3.4.3 保持离心管在磁力架上，待溶液澄清（约5分钟）后，小心弃去上清，注意不要扰动磁珠；3.4.4 保持离心管在磁力架上，沿着管壁缓慢加入200μL新鲜配制的80%乙醇，注意加入乙醇时不要扰动磁珠，孵育30秒后小心移除上清；3.4.5 重复步骤3.4.4，共漂洗两次；3.4.6 用2‑10μL移液器吸走所有残留乙醇；开盖在空气中干燥3‑5分钟；3.4.7 加入22.5μL 灭菌水混匀后静置5分钟；3.4.8 离心管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体；3.4.9 保持离心管在磁力架上，待溶液澄清（约5分钟）后，将20μL上清液转移至新的 1.5mL的离心管中；S4 捕获前PCR4.1 准备试剂如下：PCR Primer mix2、Amplification mix3、80%乙醇、AHTS DNA Clean Beads；4.2 配制反应体系：在PCR管中加入模板、PCR Primer mix2、Amplification mix3，配制完成后，涡旋并短暂离心；4.3 将配制完成的反应体系置于PCR仪上，启动反应程序；4.4 捕获前PCR产物纯化4.4.1 加45μL磁珠到上步产物中，轻轻吹打10次以保证整个体系均匀；室温孵育5分钟，使文库结合到磁珠上；4.4.2 离心管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体；4.4.3 保持离心管在磁力架上，待溶液澄清（约5分钟）后，小心弃去上清，注意不要扰动磁珠；4.4.4 保持离心管在磁力架上，沿着管壁缓慢加入200μL新鲜配制的80%乙醇，注意加入乙醇时不要扰动磁珠，孵育30秒后小心移除上清；4.4.5 重复步骤4.4.4，共漂洗两次；4.4.6 用2‑10μL移液器吸走所有残留乙醇；开盖在空气中干燥3‑5分钟；4.4.7 磁珠晾干后，将离心管从磁力架上取下，加入22.5μL水覆盖磁珠，使用移液器吹打混匀磁珠；4.4.8 室温孵育2分钟；如果磁珠干燥开裂，适当延长孵育时间；4.4.9 将离心管短暂离心后置于磁力架中，分离磁珠和液体直到溶液澄清（约5分钟）；若少量的磁珠不再吸附在磁力架上，用移液器在上清中吹打混匀未吸附的磁珠，使其重新悬浮，继续孵育直至没有磁珠残留在上清中；4.4.10 小心吸取21μL上清转移至相应编号的新的小PCR管中；4.4.11 进行Qubit定量；S5 杂交捕获5.1 准备试剂如下：探针、Cot‑1 DNA、XGen universal Blockers‑Tsmix、2×Hybridization Buffer、Hybridization Buffer Enhancer、Nuclease‑free water、2×Bead wash Buffer、10×wash Buffer I、10×wash Buffer II、10×wash Buffer III、10×stringent wash Buffer、Streptavidin Beads 270、PCR Primer Mix2、Amplification Mix3、80%乙醇、AHTS DNA Clean Beads；5.2 配制反应体系：在PCR管中加入Pool barcoded library、Cot‑1 DNA、XGen universal Blockers‑Tsmix、配制完成后，涡旋并短暂离心；5.3 将上步溶液在抽真空仪里45℃抽干35分钟；5.4 配制杂交反应体系：在抽干的PCR管中加入2×Hybridization Buffer、Hybridization Buffer Enhancer、Nuclease‑free water，配制完成后，先室温放置5分钟，吹打后再室温静置5分钟；然后将反应体系置于PCR仪中，95℃，10分钟；结束后，立刻拿出放在事先准备好的冰盒上，静置2分钟；立即加入4μL XGen lockdown probe pool，快速吹打混匀10秒，短暂离心，终体积为17μL；65℃，过夜（至少4小时）；需要说明的是，采用IDT Inc合成探针，探针区域见附表1；5.5 杂交后处理：准备1x工作液，包括Bead wash Buffer、wash Buffer I、wash Buffer II、wash Buffer III、stringent wash Buffer；在室温平衡Streptavidin Beads 270 30分钟，充分振荡混匀Streptavidin Beads 270 15秒；在1.5mL管子中加100μL Streptavidin Beads 270，将管子放在磁力架上，Beads分层，弃去上清；加入200μL1×Bead wash Buffer，涡旋10秒，放回磁力架，分层，弃去上清；再次加入200μL1×Bead wash Buffer，涡旋10秒，放回磁力架，分层，弃去上清；加入100μL1×Bead wash Buffer，振荡；将重悬的100μL Beads加到0.2mLPCR管，放到磁力架，弃去上清，立即进入下一步；5.6 将杂交产物结合到Streptavidin Beads 270上：将处理后的杂交产物放入有Beads的0.2mLPCR管中，吹打混匀10次；金属浴65℃（75℃）,45分钟；每隔15分钟，涡旋3秒，2500rpm；5.7 洗涤磁珠，弃除未结合的DNA：加入100μL1×Wash Buffer I到上步产物的管子中，短暂涡旋后转移至1.5mL管子中，将管子放在磁力架上，弃去上清；加入200μL1×stringent wash Buffer上下吹打10次；金属浴65℃，5分钟；放到磁力架上，弃去上清；再次加入200μL1×stringent wash Buffer上下吹打10次；金属浴65℃，5分钟；放到磁力架上，弃去上清； RT洗：加入200μL1×wash Buffer I，涡旋2分钟，放到磁力架，弃去上清；加入200μL1×wash Buffer II，涡旋1分钟，放到磁力架，弃去上清；加入200μL1×wash Buffer III，涡旋30秒，放到磁力架，弃去上清；重悬Beads，从磁力架上拿下EP管，加入20μLNuclease‑free water（后带Beads做PCR），上下吹打10次；S6 捕获后PCR：6.1 准备试剂如下：PCR Primer Mix2、Amplification Mix3、80%乙醇、AHTS DNA Clean Beads；6.2 配制反应体系：在PCR管中加入模板，PCR Primer Mix2、Amplification Mix3，配制完成后，涡旋并短暂离心；6.3 将配制完成的反应体系置于PCR仪上，启动反应程序；6.4 扩增后产物进行Qubit定量；6.5 捕获后PCR产物纯化6.5.1 涡旋磁珠使其充分混匀，各加75μL磁珠到上面的产物中，轻轻吹打10次以保证整个体系均匀；室温孵育5分钟，使文库结合到磁珠上；6.5.2 离心管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体；6.5.3 保持离心管在磁力架上，待溶液澄清（约5分钟）后，小心弃去上清，注意不要扰动磁珠；6.5.4 保持离心管在磁力架上，沿着管壁缓慢加入200μL新鲜配制的80%乙醇，注意加入乙醇时不要扰动磁珠，孵育30秒后小心移除上清；6.5.5 重复步骤6.5.4，共漂洗两次；6.5.6 用2‑10μL移液器吸走所有残留乙醇；开盖在空气中干燥3‑5分钟；6.5.7 磁珠晾干后，将离心管从磁力架上取下，加入22μL IDTE覆盖磁珠，使用移液器吹打混匀磁珠；6.5.8 室温孵育2分钟；如果磁珠干燥开裂，适当延长孵育时间；6.5.9 将离心管短暂离心后置于磁力架中，分离磁珠和液体直到溶液澄清（约5分钟）；若少量的磁珠不再吸附在磁力架上，用移液器在上清中吹打混匀未吸附的磁珠，使其重新悬浮，继续孵育直至没有磁珠残留在上清中；6.5.10 小心吸取20μL上清转移至相应编号的新的1.5mL离心管中，进行Qubit定量；6.5.11 杂交捕获后产物可以在‑80℃长期保存，等待最终上机测序。