[发明专利]羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法及其应用

摘要

本发明提供了羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法及其应用。羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法包括挖掘与检测羊踯躅提取物对不同癌细胞的抑制活性、羊踯躅提取物抑制癌细胞克隆形成的检测、羊踯躅提取物诱导细胞凋亡引起周期阻滞的分析、羊踯躅提取物对癌症凋亡及周期相关基因表达的分析等步骤。本发明为开发羊踯躅治疗癌症药物提供技术支持和科学依据。

主权项

1.一种羊踯躅提取物的抗癌活性检测方法，包括以下步骤：(1)挖掘、检测羊踯躅提取物对不同癌细胞的抑制活性：将待检测的几种癌细胞接种于96孔板中，在37℃、5％CO2的培养箱中孵育24小时，用不同浓度的羊踯躅提取物分别处理每种癌细胞，继续培养48～72小时后，用四唑盐比色法(MTT法)检测羊踯躅提取物对不同癌细胞细胞的增殖抑制作用；(2)羊踯躅提取物抑制癌细胞克隆形成的检测：将对数生长的结肠癌HT‑29细胞在37℃条件下继代培养24小时后，将培养液换成含不同浓度羊踯躅提取物的培养基共同培养，在37℃、5％CO2的培养箱中培养13天后，吸出培养基，用PBS冲洗，用4％多聚甲醛固定，结晶紫染色，用克隆形成数和克隆形成率来评价羊踯躅提取物对HT‑29细胞克隆形成的影响；(3)羊踯躅提取物诱导细胞凋亡引起周期阻滞的分析：将处于对数生长期的HT‑29细胞继代培养24小时后，将培养基分别替换成含不同浓度羊踯躅提取物的完全培养基，对照组加入等量的含DMSO的完全培养基培养24小时；将细胞制成单个细胞悬液离心收集细胞，通过流式细胞仪检测细胞的凋亡与周期；(4)羊踯躅提取物对癌症凋亡及周期相关基因表达的分析：将处于对数生长期的HT‑29细胞接种于6孔板中，孵育过夜；然后用不同浓度的羊踯躅提取物处理细胞12小时，收集细胞用Trizol提取细胞总RNA；用反转录系统试剂盒反向转录RNA，运用实时荧光定量试剂盒对Bax、Bcl‑2、P21和P53等基因表达水平进行定量分析；用β‑actin基因的表达水平进行归一化，并用2‑ΔΔCT计算基因的表达水平。