[发明专利]特异性抗原刺激CD4淋巴细胞表达CD69用于诊断结核杆菌感染的方法

摘要

本发明涉及特异性抗原刺激CD4淋巴细胞表达CD69用于诊断结核杆菌感染的方法，包括首先对细胞的培养和刺激，接着进行多色免疫表型标记，再以多色流式细胞术为检测平台，建立多色标记术，检测CD4⁺T淋巴细胞经结核特异性抗原ESAT‑6和CFP‑10刺激后，以及在协同分子CD49d，CD28共同作用下，结核分枝杆菌抗原致敏淋巴细胞活化的细胞表型CD4⁺CD69⁺的表达变化。本发明的方法有着操作简单的特点，且用血量与用培养基量小，使得本发明的方法还有着经济效益高和适用性广的优点，还增加了诊断的灵敏度和缩短了检测时间，适合在结核病的检测中应用和推广。

主权项

1.特异性抗原刺激CD4淋巴细胞表达CD69用于诊断结核杆菌感染的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)细胞培养：设三管；第一管为阴性对照管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入CD28和CD49d，使培养基中CD28和CD49d浓度各为0.9～0.12ug/mL后，再加入0.2～0.3mL肝素抗凝的外周血；第二管为阳性对照管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入PHA、CD28和CD49d，使培养基中PHA浓度为9～11ug/mL和CD28、CD49d浓度各为0.9～0.12ug/mL后，再加入0.2～0.3mL肝素抗凝的外周血；第三管为测定管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入ESAT‑6、CFP‑10、CD28、CD49d，使培养基中ESAT‑6和CFP‑10浓度各为4.5～5.5ug/mL，CD28和CD49d浓度各为0.9～1ug/mL后，再加入0.2～0.3mL肝素抗凝的外周血；把阴性对照管、阳性对照管和测定管放入36～38℃、4～6％CO₂培养箱中培养20～24小时；2)多色免疫表型标记与流式细胞术检测：从培养的3管全血中各取45～55uL分别加入到三根流式管中，然后，每根流式管中加入CD4‑FITC、CD69‑APC各4～6uL，常温避光15～20min；加NH₄Cl溶血素400～450ul，轻微振荡混匀；调整流式细胞仪中前向与侧向散射光的电压，根据CD4‑SS设门，取CD4⁺细胞分析CD4⁺CD69⁺群细胞百分率，测定结果为测定管的CD4⁺CD69⁺群细胞百分率－阴性对照管的CD4⁺CD69⁺群细胞百分率。