[发明专利]一种鉴别鱼油中掺加棕榈油的方法

摘要

本发明公开了一种鉴别鱼油中掺加棕榈油的方法，属于食品检测领域，通过改进鱼油(或鱼油与棕榈油混合样品)DNA的提取方法，获取得到较高质量的DNA。进一步利用16s rRNA(动物源性)、VTE4(棕榈油的特征基因)等分子的保守/特异序列在分子水平上对鱼油产品进行鉴定，判定鱼油中是否掺杂棕榈油，从而对鱼油品质进行评价。本发明方法具有较强的特异性与灵敏性，0.01％浓度的棕榈油掺入鱼油中亦可特异性检出。该方法的灵敏性远胜于薄层色谱技术、光谱法、电导法以及质谱技术等各类化学方法。同时大大缩短了检测时间，降低了检测成本，具有无可比拟的优点，适宜大范围推广应用。

主权项

1.一种鉴别鱼油中掺加棕榈油的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)水相制备：取鱼油样品、无菌ddH2o置于灭菌烧杯中，鱼油样品与无菌ddH2o的体积比为10：1，充分混匀后置于磁力搅拌器中搅拌1h，4℃条件下12000rpm离心2min，弃上层油脂，向下层水相再次加入相同体积的鱼油，重复上述操作3次，保存水相；(2)裂解消化：取2ml步骤(1)中的水相至离心管，加入等体积预热至65℃的CTAB裂解液与蛋白酶K，涡旋混匀，65℃温育30min，得样品裂解液；(3)分步抽提：对步骤(2)中的样品裂解液先使用等体积平衡酚进行抽提1次，对上清液再进一步使用等体积氯仿：异戊醇混合液抽提2次，所述混合液中氯仿：异戊醇的体积比为24：1，得上清液，放置5min，然后4℃条件下12000rpm离心10min；(4)沉淀DNA：取步骤(3)中的上清液，加入0.8倍体积的‑20℃预冷的异戊醇和0.1倍体积的3mol/l NH4Ac，颠倒混匀后全部转移至核酸纯化吸附柱，收集液于‑20℃静置30min后再次转入核酸纯化吸附柱，取出吸附柱，弃去收集管内液体，用1ml体积分数为75％的乙醇溶液冲洗吸附柱，室温下静置5min，使乙醇充分挥发；随后将吸附柱取出放入新的离心管，向吸附柱中加入50μl TE溶液，静置3min，4℃条件下12000rpm离心1min，DNA溶液即被收集在离心管中；(5)选择16s rRNA为内参引物，VTE4为目的基因引物，序列分别为SEQ NO.1、SEQ NO.2，以步骤(4)中获得的DNA作为模板进行荧光定量PCR反应，每个反应作3个重复，反应体系为表1；表1.荧光定量反应体系反应条件为：94℃，30s；94℃5s，60℃20s，72℃20s，44个循环；(6)结果判定：PCR反应结束后，比较收集得到的荧光曲线，不掺有棕榈油样品中VTE4基因未见扩增，其动力学曲线近似直线，掺加有棕榈油样品VTE4基因扩增的动力学曲线出现单峰，有可见特异性扩增。