[发明专利]一种克服二倍体马铃薯自交不亲和的方法

摘要

本发明公开的一种克服二倍体马铃薯自交不亲和的方法，包括(1)选取靶标片段；(2)构建基因打靶的重组载体；(3)实现细胞内S‑RNase基因的功能缺失突变；(4)再生若干个马铃薯植株；(5)特异性扩增再生植株中S‑RNase基因包含靶标片段的DNA区段；(6)选择S‑RNase基因被编辑的再生植株；(7)对所选基因编辑植株进一步筛选出二倍体的基因编辑株系；(8)扩繁并定植所选基因编辑株系，于开花期进行自交亲和性表型鉴定；(9)对收获自交亲和性植株后代扩增产物测序，检测被编辑靶标基因在后代的遗传和分离。本发明的优点在于，找到一种简便、精准、高效的方法克服二倍体马铃薯自交不亲和。

主权项

1.一种克服二倍体马铃薯自交不亲和的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)在马铃薯自交不亲和决定基因S‑RNase基因S_p3和S_p4的基因区域选取靶标片段；(2)根据步骤(1)得到的靶标片段的核酸排列顺序，构建用于二倍体马铃薯S‑RNase基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体；(3)将步骤(2)得到的重组载体导入到马铃薯细胞，诱导所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在细胞中共同表达，剪切S‑RNase基因的双链靶标片段，触发马铃薯细胞自身的DNA修复功能，导致靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内S‑RNase基因的功能缺失突变；(4)用导入了所述重组载体的马铃薯细胞再生若干个马铃薯植株，对所选再生植株进行标记基因筛选；(5)通过基因组PCR方法特异性扩增所选再生植株中S‑RNase基因包含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序；(6)选择S‑RNase基因被编辑的再生植株；(7)检测所选基因编辑植株的染色体倍性，以筛选出二倍体的基因编辑株系；(8)扩繁并定植所选基因编辑株系，于开花期进行自交亲和性表型鉴定；(9)收获自交亲和性株系所结种子，提取后代基因组DNA，通过PCR方法特异性扩增所选后代中S‑RNase基因包含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序，检测被编辑靶标基因在后代的遗传和分离。