[发明专利]一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法

摘要

本发明属于动物繁育领域，具体涉及一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法。该方法包括离体盘羊睾丸组织的冷冻保存，冷冻盘羊睾丸组织中精子分离，绵羊卵母细胞体外培养成熟，胞浆单精子注射ICSI，ICSI胚胎体外培养等步骤。本发明中所涉及的睾丸组织精子分离技术操作简单省时，不需要考虑杂细胞、精子数量和活力的因素，填补了利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎技术的空白。

主权项

1.一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，离体盘羊睾丸组织的冷冻保存，备用将离体的盘羊睾丸组织剥去外膜后，将睾丸实质部分剪碎并置于含冻存液的冻存管中，4℃放置2‑3h后投入液氮中长期冷冻保存，备用；S2，冷冻盘羊睾丸组织中精子分离将液氮中冻存的盘羊睾丸组织取出，解冻，将解冻的睾丸组织混匀后离心，弃上清，并用羊精子上浮液清洗沉淀，最后将沉淀用羊精子上浮液液悬浮，制成精子悬液，备用；S3，绵羊卵母细胞体外培养成熟从离体的绵羊卵巢采集卵丘卵母细胞复合体，并培养至排出第一极体，得到含有第一极体的成熟卵母细胞，备用；S4，胞浆单精子注射ICSI准备ICSI注射盘：用羊精子上浮液液分别配制12g/100mL、6g/100mL的聚乙烯吡咯烷酮溶液，取容器作为ICSI注射盘，在ICSI注射盘上分别制作羊精子上浮液液注射滴、12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴、6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴和S2的精子悬液滴，每个液滴上覆石蜡油；ICSI操作：取熟卵母细胞置于羊精子上浮液液注射滴中，将ICSI注射盘置于37℃恒温板的显微镜下，在4倍镜下将注射针移至12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴中反复吸吹几遍后，再移至精子悬液滴中，20倍镜下吸取单个精子，再移至6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴中确定精子在针中的位置，并弹掉针壁上沾上的多余精子，最后将注射针移至羊精子上浮液液注射滴中，10倍镜下用持卵针调整并固定卵母细胞，使第一极体处于12点钟或6点钟位置，将注射针内的精子推至针尖处，在3点钟方向进注射针，进注射针后先回吸少量的胞质后再注射精子，注射后将活的卵母细胞置于G1发育液中准备进行孤雌激活处理；S5，ICSI胚胎体外培养孤雌激活处理后的胚胎在饱和湿度的培养箱中继续培养，48h后在G1发育液滴中加入体积分数10％FBS继续培养至72h，在第3d移入G2发育液中继续培养至7‑8d，得到盘羊‑绵羊杂交囊胚。