[发明专利]一株烟草气候斑点病的生防菌株内生贝莱斯芽胞杆菌

摘要

本发明涉及农业微生物学技术及生物防治技术的技术领域，特别是涉及一株烟草气候斑点病的生防菌株内生贝莱斯芽胞杆菌,本发明提供了一株生防菌(2R,3R)‑2,3‑丁二醇脱氢酶(butanediol dehydrogenase,2,3‑bdh）敲除菌GJ11△bdh用于防治烟草气候斑点病的方法。将不同物质作用于烟草根部，通过室内气候斑模拟，发现乙偶姻能够防治气候斑点病。在恩施州烟草气候斑点病发病区域筛选得到一株产乙偶姻的贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）GJ11，通过气候斑模拟，该菌株对烟草气候斑具有较低的防治效果。通过敲除贝莱斯芽孢杆菌的2,3‑bdh基因，发现该菌的乙偶姻产量显著提高，该菌株对烟草气候斑的防治显著提高。通过生理生化检测，发现GJ11△bdh发酵液能够提高烟草的抗氧化酶的活性，降低植物体内由臭氧引起的活性氧浓度。

主权项

1.一株烟草气候斑点病的生防菌株内生贝莱斯芽胞杆菌，其特征在于，其实验过程包括以下步骤：（1）烟草气候斑生防细菌的筛选及鉴定：a、烟草内生及根际细菌的分离：分别称取0.5 g根、茎和叶，分别用75%乙醇溶液进行消毒30 s，用无菌水冲洗两次，分别用0.1%升汞浸泡1 min，无菌水冲洗三次，分别加入5 ml无菌水研磨充分，梯度稀释后，分别涂布于LB平板，37℃培养48 h，挑取菌落形态不同的细菌分离纯化，将纯化的菌株‑20℃甘油管保存；b、乙偶姻对烟草气候斑的防治效果：选取5~7片叶的烟草，向烟草灌根50 mL浓度分别为2 g/L，4 g/L和6 g/L的乙偶姻溶液，室温培养三天，第四天时浇水50 mL，模拟气候斑点病的发生；c、高产乙偶姻细菌的筛选：接种筛选到的细菌于LB培养基中，37℃，180 rpm过夜活化，转接1%活化菌液于8%葡萄糖的LB液体培养基37℃，180 rpm培养48 h，用气相色谱的方法检测乙偶姻浓度，筛分出一株高产乙偶姻的菌株GJ11；d、GJ11对烟草气候斑的防治效果：挑取GJ11单菌落于液体培养基中，37℃，180 rpm过夜活化，转接1%活化菌液于含8%葡萄糖的液体LB培养基中，37℃，180 rpm培养48 h，选取5~7叶时期的烟草，向烟草灌根50 mL发酵液，灌根50 mL清水作为对照，在室温下培养三天，第四天时浇水50 mL，放入培养箱中模拟气候斑点病的发生；e、菌株16sDNA基因序列分析鉴定：将16sDNA基因扩增产物纯化后测序，通过NCBI数据库进行BLAST比对，采用MEGA5.2软件构建拮抗菌的系统发育树，鉴定菌株GJ11菌种；（2）高产乙偶姻工程菌GJ11△bdh的构建：a、T2‑bdh表达载体的构建：对bdh基因L臂与R臂片段进行的PCR扩增并跑胶验证，将相关片段进行纯化回收，并以L臂与R臂为模板，进行SOE‑PCR，重组载体构建，大肠杆菌转化，重组子的筛选和重组质粒验证；b、GJ11△bdh菌株的构建：挑选转化GJ11‑bdh菌株,接种至10 mL含有Km抗性（20 µg/mL）的LB培养基中，42℃培养，至菌液浑浊，稀释涂Km抗性（20 µg/mL）平板37℃培养，挑单菌落，抽提其总DNA，分别设计单交换验证引物，L臂单交换，R臂单交换，取相应引物，以提取总DNA为模板，20 µL体系进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，挑选单交换菌株；挑选单交换菌株WH1‑dan‑bdh，于5 mL无抗性LB培养基中，28℃、200 rpm培养24 h，稀释涂平板，挑单菌落分别点菌至LB平板和Km抗性（20 µg/mL）平板，挑取抗性丢失菌株，提取总DNA，分别以L臂上游100 bp序列为F引物，以R臂下游100 bp序列为R引物，20 µL扩增体系扩增，对测序引物bdh‑dan‑LF 、bdh‑dan‑RR，在NCBI进行Blast比对；（3）GJ11与GJ11△bdh的乙偶姻产量及气候斑防效变化：挑取GJ11和GJ11△bdh单菌落于LB液体培养基中，37℃，180 rpm过夜活化，1%转接于含8%葡萄糖的液体LB，37℃，180 rpm培养，每隔12 h取样检测一次乙偶姻含量；选取5~7叶时期的烟草，向烟草灌根上述48 h的发酵液50 mL，清水处理作为对照，在室温下培养三天，第四天时浇水50 mL，放入培养箱中模拟气候斑点病的发生；（4）GJ11△bdh发酵液对活性氧影响：烟草的处理方式同步骤（3），在处理过程中每隔3 h用打孔器取8片叶子：a、过氧化氢的检测：将叶片浸泡于由0.01M磷酸缓冲液配制而成的1 mg/mL（pH3.8）的DAB溶液8h，用乙醇：甘油（9：1 V/V）95℃，5 min除叶绿素，10倍镜检，观察有无H₂O₂产生，棕色斑点代表有H₂O₂产生；b、超氧根离子的检测：将叶片浸泡于含0.01%NBT的0.01M磷酸盐缓冲液，黑暗浸泡60 min，生产物稳定呈深绿色斑点，在曝光2 h，乙醇：甘油（9:1V/V）95℃，5 min除叶绿素，10倍镜检，观察有无深绿色斑点产生，深绿色斑点代表有超氧根离子产生；（5）GJ11△bdh发酵液对烟草相关酶活的影响：a、GJ11△bdh发酵液对烟草SOD酶活的影响：使用NBT光还原法测定SOD酶活，一个酶活单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半时所需的酶量，观察SOD酶活变化情况；b、GJ11△bdh发酵液对烟草POD酶活的影响：愈创木酚法测定POD活性，观察POD酶活变化情况；c、GJ11△bdh发酵液对烟草CAT酶活的影响：紫外吸收法测定CAT酶活，观察CAT酶活变化情况。