[发明专利]一种结核分枝杆菌耐药性检测方法

摘要

本发明属于生物技术技术领域，具体的说是一种结核分枝杆菌耐药性检测方法，该方法包括如下步骤：裂解结核分枝杆菌用于PCR反应的模板；设计PCR引物，扩增全长的吡嗪酰胺酶(pncA)基因；浓缩扩增的pncA基因片段并定量；采用小麦胚芽无细胞表达系统表达pncA酶；测定表达的pncA酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性，并与同样表达的结核杆菌标准敏感株和耐药株的pncA酶活性比较，测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性；本发明通过使用一对引物就能测定因pncA基因突变导致的耐药性；同时公开了即能从结核杆菌基因组上扩增全长pncA基因又适合小麦胚芽无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶的引物序列；进而实现快速、灵敏检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性，且无需细菌培养。

主权项

1.一种结核分枝杆菌耐药性检测方法，其特征在于,该方法包括如下步骤：S1：通过液氮低温研磨方法实现将结核分枝杆菌的菌壁破碎，释放结核分枝杆菌基因组；S2:根据S1中裂解后的结核杆菌基因组中全长吡嗪酰胺酶基因的上下游序列设计PCR引物序列，引物序列不与吡嗪酰胺酶基因序列重叠，完整反应全长pncA基因，且PCR引物序列上同时带有适合小麦胚芽无细胞表达系统的启动子，或者同时带有启动子和增强表达子；所述的启动子的引物序列为：5'‑TAATACGACTCACTATAGG‑3'；所述的表达增强子的引物序列为：5'‑ATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGC‑3'；S3:通过高速离心方法对S2中的结核杆菌基因组进行浓缩，在浓缩的过程中进行抽真空；同时通过紫外吸收法对该结核杆菌基因组进行定量处理，通过紫外线灯实现精确控制光线的强度，进而实现高精度控制用于表达吡嗪酰胺酶的基因模板量；S4:取S3中的结核杆菌基因组5‑15微克植入小麦胚芽无细胞体中进行表达，表达时间为1‑24小时；S5:通过分光光度计测定S4中表达的吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性，并与同样表达的结核分枝杆菌标准敏感株和耐药株的吡嗪酰胺酶活性比较，测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性。