[发明专利]一种增强型荧光蛋白在审
| 申请号： | 201910134361.8 | 申请日： | 2019-02-22 |
| 公开（公告）号： | CN109734815A | 公开（公告）日： | 2019-05-10 |
| 发明（设计）人： | 冷毅斌;吴娟;寇小娟 | 申请（专利权）人： | 武汉巴菲尔生物技术服务有限公司 |
| 主分类号： | C07K19/00 | 分类号： | C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70 |
| 代理公司： | 武汉蓝宝石专利代理事务所(特殊普通合伙) 42242 | 代理人： | 廉海涛 |
| 地址： | 430000 湖北省武汉市东湖新技术开发区高新二路*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明提供一种增强型荧光蛋白，包括：以引物E1、E2克隆EGFP基因后，利用引物上的Bsa Ⅰ、Not Ⅰ酶切位点将片段制备出粘性末端；利用连接酶将基因插入相应的SUMO载体，获得的重组载体pSUMO‑EGFP；将构建好的pSUMO‑EGFP转化Rosetta(DE3)；挑取单克隆于LB培养基，氨苄青霉素120mg/L，37℃培养过夜；在纯化后的SUMO‑EGFP内加入用于引导SUMO‑EGFP表达的信号肽序列或信号肽序列的突变序列或信号肽序列的嵌合序列，得到增强型的SUMO‑EGFP。增强型荧光蛋白可应用于多个领域的研究，例如作为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记。 | ||
| 搜索关键词： | 增强型 信号肽序列 荧光蛋白 引物 氨苄青霉素 蛋白定位 基因表达 基因插入 嵌合序列 突变序列 细胞分化 粘性末端 重组载体 活细胞 连接酶 构建 酶切 制备 克隆 发育 监测 转化 应用 研究 | ||
【主权项】：
1.一种增强型荧光蛋白，其特征在于，包括：以引物E1、E2克隆增强绿色荧光蛋白EGFP基因后，利用引物上的BsaⅠ、NotⅠ酶切位点将片段制备出粘性末端；利用连接酶将基因插入相应的SUMO载体，获得的重组载体pSUMO‑EGFP；将构建好的pSUMO‑EGFP转化Rosetta(DE3)；挑取单克隆于LB培养基，氨苄青霉素120mg/L，37℃培养过夜；将过夜培养物以1∶80的比例接种至0.6L的LB培养基中，35℃培养至OD600为0.4时，加入IPTG使其终浓度达0.20mmol/L，30℃继续培养5h后，离心收获菌体，得到SUMO‑EGFP融合蛋白；收获的菌体以缓冲液重悬，进行超声破碎；5℃、10000×g离心，留取细菌裂解上清并进行纯化，得到纯化后的SUMO‑EGFP融合蛋白；在纯化后的SUMO‑EGFP融合蛋白内加入用于引导SUMO‑EGFP融合蛋白表达的信号肽序列或信号肽序列的突变序列或信号肽序列的嵌合序列，得到增强型的SUMO‑EGFP融合蛋白。
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