[发明专利]一种三疣梭子蟹几丁质酶基因及其重组表达蛋白和应用

摘要

本发明公开了一种三疣梭子蟹几丁质酶基因及其重组表达蛋白和应用。本发明通过进行三疣梭子蟹几丁质酶PtCht4基因克隆，利用PtCht4基因编码蛋白的核苷酸序列构建原核表达载体，筛选出一种能够高效表达三疣梭子蟹PtCht4基因重组蛋白的表达体系，通过蛋白纯化与复性获得能够正确折叠且具有活性的重组蛋白。本发明将重组蛋白用于体外抑菌，由于PtCht4基因属于三疣梭子蟹的内源基因，由此表达产出的蛋白制成的药物使机体不会产生排斥反应，且能够激发机体的非特异性免疫系统，降低细菌的耐药性，体外抑菌技术的实现可为蟹类新型药物的研究提供一种新的思路。

主权项

1.三疣梭子蟹几丁质酶PtCht4基因的重组表达蛋白在制备抑菌剂中的应用，其特征在于：所述抑菌剂中重组表达蛋白的浓度为5mg/mL‑25mg/mL，所述抑菌剂用于抑制副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌；所述三疣梭子蟹几丁质酶PtCht4基因的核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示，所述三疣梭子蟹几丁质酶PtCht4基因的重组表达蛋白的制备方法包括以下步骤：（1）克隆几丁质酶基因；（2）重组表达载体的构建：对几丁质酶基因进行开放阅读框的扩增，对PCR产物和pET‑28a质粒进行双酶切，并进行PCR扩增，回收纯化产物，将连接体系和感受态细胞混合，加入培养基，涂板培养，以T7、T7teminator引物筛选目的菌株；（3）重组蛋白的诱导表达：将目的菌株接种于培养基培养，转移到感受态细胞，将得到的菌株进行诱导表达；（4）重组蛋白的分离纯化：将诱导表达成功后的菌株扩大培养，将得到的菌体加入裂解液，超声破碎后离心，得到以包涵体的形式在表达菌株中存在的目的蛋白，将包涵体洗涤、纯化；（5）重组蛋白的复性：将纯化后的重组蛋白装入透析袋，依次用透析液透析，最后离心、取上清，得到重组表达蛋白。