[发明专利]一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法

摘要

本发明公开了一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，包括以下步骤：S1：对乳腺癌细胞进行培养；S2：通过对乳腺癌细胞PCR扩增，建立表达系统；S3：对乳腺癌细胞系进行构建，S4：进行细胞观察和荧光强度对比。本发明通过实时荧光定量PCR检测HER2基因在mRNA中的表达情况，以证明细胞系构建成功。本发明构建的乳腺癌细胞系可以稳定表达HER2基因，具有整合效率高，假阳性率低等优点，为进一步研究HER2基因乳腺癌发生、发展、治疗及后续耐药过程中提供基本且有力的研究工具。

主权项

1.一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将新鲜的乳腺癌细胞在含有10％FBS的液体培养基中，在温度为30‑35℃条件下培养1‑2h,然后用FBS充分洗涤后，置于转动频率为50‑80r/min、温度为20℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，对培养后的细胞通过灭菌处理，再100目过滤，进行转接培养3‑5次，再在水浴温度为30℃、通气量为5‑10m³/h的条件下震荡处理2‑4h，得到乳腺癌细胞；S2：提取乳腺癌细胞的总mRNA，将总mRNA进行稀释后放入到反应离心管，在温度为60‑75℃的条件下，加入反转录缓冲液，然后温度按照1.5℃/min的降温速率下降至20‑30℃，向其加入反转录酶、DNA聚合酶，期间不断用磁力棒搅拌处理，处理30‑45min，得到cDNA，再对得到的cDNA通过上下引物分别进行PCR扩增，通过切酶SnaBI剪切，进行琼脂凝胶电泳，通过pBS‑T Mini Kit中片段连接的方法，分别克隆到pBS‑T载体中，通过电泳结果筛选及其琼脂糖凝胶电泳，获得质粒；S3：所述质粒作为模板，pGenesil‑1载体，构建出相应的pGenesil‑ETV1A、pGenesil‑ETV1B、pGenesil‑ETV1C、pGenesil‑NC重组siRNA表达载体；在200μlPCR管中配制如下连接体系：pGenesil‑1/HindⅢ/BamHⅠ载体大片段1μl；双链片段DNA5ul；T4DNAligase1ul；10×T4DNAligasebuffer1ul；ddH₂O₂μl。以上体系配制好后放入金属浴，16℃反应4小时，将连接产物全部加入到100μlDH5α感受态中，冰浴15min，加入500μlLB液体培养基，在温度为30℃，70rpm条件下，振荡培养1h，然后在35℃热激90s后立即冰浴100s，取150μl培养物涂布于LB/Kan平板上37℃倒置培养10小时；S4：对培养后培养物进行转染Marc‑145细胞，通过消化，振荡过滤将Marc‑145细胞重选，调节细胞悬浮液密度，培养3‑6h，然后将培养后的Marc‑145细胞放入到四孔板中培养，待细胞密度为60‑70％时，向四孔中分别加入转染试剂离心搅拌，观察细胞病变，培养4代后，加入含有乳腺癌细胞的新鲜培养基培养3‑5h，洗涤，观察细胞状态及荧光强度。