[发明专利]一种清香型白酒酿造过程中微生物群落结构的分析方法

摘要

本发明涉及生物信息学和生物技术领域，具体涉及一种清香型白酒酿造过程中微生物群落结构的分析方法。该方法通过将不同抗生素组合应用，提高传统微生物分离计数的准确性微生物分离，利用高通量测序对微生物进行种属变化分析，根据结果确定出清香型白酒酿造过程中主体微生物，随之建立参考基因组，根据宏转录组测序数据比对参考基因组确定清香型白酒中活体微生物变化规律。本发明方法的有益效果在于：有效的抑制了培养基中杂菌的生长，大大提高了传统微生物分离计数的准确性，并有效获得活体菌株；同时结合高通量测序分析及宏转录测序分析，有效地弥补各方法之间的不足，能够准确全貌地解析清香型白酒发酵过程微生物的群落结构。

主权项

1.一种清香型白酒酿造过程中微生物群落结构的分析方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1：将样品与无菌水混合，稀释涂布不同培养基分离培养微生物发酵菌群：（1）酵母分离培养基：酵母浸粉10g、葡萄糖20g、蛋白胨20g、琼脂20g、营养液10mL、蒸馏水1000mL、115℃灭菌30min，室温冷却50～60℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，28～30℃培养24～48h计数挑菌；（2）常温丝状真菌分离培养基：KH₂PO₄ 1g、酵母浸粉5g、蔗糖30g、琼脂20g、营养液10mL、NaNO₃ 3g、KCL 0.5g、MgSO₄.7H₂O 0.5g、FeSO₄.7H₂O 10 mg、CuSO₄.5H₂O 5mg、ZnSO₄.7H₂O 10mg、水1000mL，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，30～35℃培养24～48h计数挑菌；（3）高温丝状真菌分离培养基：土豆浸提液200mL、葡萄糖20g、琼脂20g、水600mL、营养液200mL，115℃灭菌30min，室温冷却50～60℃，加入3mL抗生素c后倾倒平板，分离样品预先经50℃水浴20min处理，50℃培养24～72h计数挑菌；（4）芽孢杆菌分离培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NACL10g、琼脂20g、营养液10mL、水1000mL，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b后倾倒平板，分离样品预先经80℃水浴20min处理，30～35℃培养24～48h计数挑菌；（5）乳酸菌分离培养基①：牛肉膏10g、酪蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、吐温801mL、K₂HPO₄ 2g、MgSO₄.7H₂O 0.58g、MnSO₄.H₂O 0.25g、营养液100mL、蒸馏水900mL，115℃灭菌30min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a后倾倒平板；（6）乳酸菌分离培养基②：牛肉膏10g、酪蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺2g、吐温801mL、K₂HPO₄ 2g、MgSO₄.7H₂O 0.58g、MnSO₄.H₂O 0.25g、营养液300mL、蒸馏水700mL，115℃灭菌30min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、5%无水乙醇后倾倒平板；（7）放线菌分离培养基：酵母浸粉4g、麦芽膏5g、葡萄糖4g、琼脂20g、营养液100mL、水900毫升、维生素1mL、CuSO₄.5H₂O 6.4g、FeSO₄.7H₂O 1.1g、MnCL₂.4H₂O 7.9g、ZnSO₄.7H₂O 1.5g，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、1mL抗生素d后倾倒平板，分离样品预先经50℃水浴20min处理，15～25℃暗处培养5～30d计数挑菌；（8）高温放线菌培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、胰蛋白胨3g、NaCl 5g、营养液400mL、维生素1mL、CuSO₄.5H₂O 6.4g、FeSO4.7H₂O 1.1g、MnCL₂.4H₂O 7.9g、ZnSO₄.7H₂O 1.5g、琼脂20g、水600mL，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b、1mL抗生素a、1mL抗生素d后倾倒平板；分离样品预先经80℃水浴20min处理，50℃培养1～8d计数挑菌；（9）LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、营养液100mL、蒸馏水900mL，121℃灭菌20min，室温冷却50～60℃，加入0.4mL抗生素b后倾倒平板；步骤2：利用步骤1中不同分离培养基将样品中微生物分为酵母菌、细菌、丝状真菌三类，根据平板菌落数对样品中微生物进行定量分析，同时在每一类分离培养平板中，选取菌落数量在20～100以内的平板，挑取其上所有菌落，采用分子方法进行种属鉴定，鉴定片段为：酵母菌26srDNA序列，细菌16srDNA序列，丝状真菌18srDNA，将鉴定结果结合菌落数定量分析获得样品中微生物数量变化规律；步骤3： 提取步骤2样品中微生物总DNA，利用Illumina MiSeq PE300进行高通量测序分析，获得样品中微生物的种属变化规律；步骤4：根据步骤2的微生物分离及鉴定结果和步骤3的微生物高通量种属测序结果，确定样品中主体微生物种类，构建主体微生物参考基因组数据库；步骤5：提取步骤2样品中微生物总RNA，利用Hiseq2000进行宏转录组测序分析，将宏转录组测序数据与步骤4构建的参考基因组数据进行比对，获得样品微生物表达量，从而确定样品活体微生物变化规律；步骤6：将步骤2的微生物分离、步骤3的高通量测序分析及步骤5宏转录组测序数据相结合，利用宏转录组测序结果反馈微生物分离及高通量测序结果，从而分析出样品中微生物数演替规律。