[发明专利]外周血浆中EGFR基因T790M位点突变的检测方法及应用

摘要

外周血浆中EGFR基因T790M位点突变的检测方法，根据EGFR基因序列，设置一对扩增引物，包括上游引物和下游引物，根据T790M(c.2369C>T,COSM6240)突变序列；设置检测野生型序列的探针和检测突变型序列的探针；采用上述扩增引物和探针进行ddPCR，并优化出低频突变检出的最佳条件；仅需无创方式获得外周血即可检测T790M突变，检测灵敏度最高可达到0.0625％，不仅可以准确检测组织、体液样本，还可以处理血浆/血清等难度高的样本。可指导肿瘤靶向药物使用，还可用于肿瘤的早期诊断。

主权项

1.外周血浆中EGFR基因T790M位点突变的检测方法，其特征在于，根据EGFR基因序列，设置一对扩增引物，包括上游引物和下游引物，根据T790M(c.2369C>T,COSM6240)突变序列；设置检测野生型序列的探针和检测突变型序列的探针；采用上述扩增引物和探针进行ddPCR，并优化出低频突变检出的最佳条件；进一步的，应用该方法进行病人组织、血液等样本的检测；对EGFR T790M位点突变进行检测的方法，具体包括以下步骤：1)根据EGFR基因序列，设计特异性扩增外显子20引物对；根据T790M突变序列设计分别检测野生型模板和突变型模板的探针对；采用上述引物和探针，进行ddPCR，并优化出低频突变检测的最佳条件；2)抽提样本的核酸；选择适合样本类型的方法抽提核酸，所述样本类型包括外周血细胞、外周血血浆/血清、体液、腔道的脱落物、病变组织；特别地，对于血液样本的游离核酸抽提，步骤如下：第一、采血管的选择；如果采用普通采血管，不能含有肝素，而且需要在4h内分离血浆，如果血液不能及时处理，需选用含血细胞稳定技术的采血管；第二、血浆的分离；血浆的分离：第一步低速离心去除细胞，4℃、1900g、10min；第二步高速离心进一步去除细胞来源核酸杂质，4℃、16000g、10min；第三、裂解；每毫升血浆加入100ul Proteinase K和0.8ml Buffer ACL，且每个样本加入1ug carrier RNA；60℃孵育30min；每毫升血浆加入1.8ml缓冲液ACB；涡旋混匀；冰浴5min；第四、核酸吸附至硅膜；将第三步裂解液加入核酸吸附柱；第五、清洗；分别使用缓冲液ACW1、ACW2和96‑100％乙醇清洗核酸吸附柱；第六、乙醇去除；56℃、10min挥发乙醇；第七、洗脱；20‑100ul AVE洗脱核酸；3)ddPCR；第一，PCR体系的配置；在试剂准备区按照下表配置PCR体系：2×ddPCR Supermix for Probe(No dUTP)计10ul，引物1(1‑790‑F)计1.1ul，引物2(1‑790‑R)计1.1ul，探针1(WTp‑T790M)计0.55ul，探针2(MTp‑T790M)计0.55ul，模板5ul，加水补齐至22ul；第二、加模板；在样本制备区按照以下顺序加入模板：空白对照、阴性对照、弱阳性对照、阳性对照；第三、微滴的生成；在微滴生成区，将20ul PCR反应液加入微滴生成卡的样本孔，70ul微滴生成油加至微滴生成卡的加油孔，加样结束后用密封垫密封微滴生成卡，然后置于微滴发生仪内，启动并生成微滴；用移液器小心转移微滴至effendorf 96孔PCR板，覆盖上热封膜，在热封仪内以180℃、5s参数进行热封；第四、PCR；经过退火温度优化实验，发现56.3℃退火15s，数字PCR效果最优；按照以下程序进行PCR：95℃10min，由94℃30s，经56.3℃15s，到72℃15s反复40个循环，98℃10min，升降温速率2℃/s；第五、读板；提前预热Bio‑rad QX200仪器；打开程序QuantaSoft，设置FAM/HEX检测通道，开始读板；根据读板结果，判断样本阳性或者阴性。