[发明专利]一种脂肪干细胞提取方法

摘要

本发明公开了一种脂肪干细胞提取方法，属于干细胞提取技术领域。本发明脂肪干细胞提取的方法包括脂肪获取、洗涤、消化、清洗、裂解红细胞、终止裂解、培养、复种、传代及鉴定步骤。该方法中以细胞洗涤液对脂肪组织进行反复洗涤，有效去除脂肪油滴；以消化酶消化细胞间质中的胶原纤维释放细胞，对细胞损伤小，游离出的细胞在间充质基础培养基中保持细胞的活性；对细胞培养瓶上清中未贴壁的细胞进行传代培养，提高了细胞的存活率，增加了细胞的增殖速度。本发明的提取方法，简便快捷；脂肪组织酶解彻底，各成分细胞被最大化释放；获得的脂肪干细胞存活率高。

主权项

1.一种脂肪干细胞提取方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）脂肪获取：从年龄18~45岁，无系统性疾病、传染病和性病的志愿者体内无菌获取脂肪组织；（2）洗涤：取无菌获取的脂肪组织20 mL，用1~2倍体积的洗涤液重悬脂肪组织，静置5~10 min，分层后留上层脂肪组织，再加入1~2倍体积的洗涤液重悬，静置5~10 min，弃下层液体，如此重复洗涤5~8遍后400~500 rpm离心8~10 min，弃下层液体；（3）消化：加入1~2倍体积的消化酶酶液，置于37℃，150~200 rpm摇床中消化30~60 min，400~500 rpm离心8~10 min，弃上清液体；（4）清洗：加入2~3倍体积的生理盐水重悬，400~500 rpm离心8~10 min，弃上清液体；（5）裂解红细胞：加入1~2 mL红细胞裂解液，混匀后冰上孵育4~5 min，每隔1 min振荡一次；（6）终止裂解：加入10~20 mL PBS，300~400 g离心5~8 min，弃上清；（7）培养：加入15 mL间充质干细胞无血清完全培养基重悬，转移至细胞培养瓶，置于37℃，5% CO₂细胞培养箱培养；（8）复种：培养48 h后，取细胞培养基上清，置于无菌离心管中，400~500 rpm离心8~10 min，取出离心后的离心管，弃上清，加入15 mL间充质干细胞无血清完全培养基重悬后，转移至新的细胞培养瓶中，放入细胞培养箱继续培养；（9）传代：每隔3 d更换间充质干细胞无血清完全培养基，待细胞长至细胞培养瓶面积的60%时，用10 mL生理盐水洗涤2次，加入5 mL胰酶消化液消化1~3 min后，5 mL加入间充质干细胞无血清完全培养基终止消化，收集消化后细胞，为P0代细胞，按10000个/cm²的细胞密度进行传代，并扩增至P6代；（10）鉴定：利用流式检测方法对提取的脂肪干细胞进行表面标记物表达水平进行检测。