[发明专利]一种表达鸡ST3GAL 1基因的MDCK稳转细胞株的构建方法在审
| 申请号： | 201910169369.8 | 申请日： | 2019-03-06 |
| 公开（公告）号： | CN110029129A | 公开（公告）日： | 2019-07-19 |
| 发明（设计）人： | 方倪冉;陈瑞爱;赖汉漳 | 申请（专利权）人： | 华南农业大学;肇庆大华农生物药品有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867 |
| 代理公司： | 广州市越秀区哲力专利商标事务所(普通合伙) 44288 | 代理人： | 谢嘉舜 |
| 地址： | 510000*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明公开一种基于慢病毒转染的表达鸡ST3GAL 1基因的MDCK稳转细胞株的构建方法，该方法使用悬浮母细胞，通过DMEM生长培养后得到贴壁细胞，稳定传代后进行转染实验，稳转成功并经传代培养至二十代后驯化成悬浮细胞进行接毒实验，相较于贴壁细胞生产禽流感病毒疫苗具有更大优势。 | ||
| 搜索关键词： | 稳转细胞株 贴壁细胞 构建 转染 禽流感病毒疫苗 传代 传代培养 方法使用 悬浮细胞 基因 慢病毒 母细胞 驯化 悬浮 生长 成功 生产 | ||
【主权项】：
1.一种表达鸡ST3GAL 1基因的MDCK稳转细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建慢病毒载体：使用慢病毒骨架载体与加标签的ST3GAL 1基因序列进行连接，得到慢病毒表达载体；转化感受态，提取阳性质粒；2)慢病毒包装：将慢病毒载体、空转载体和辅助质粒共转染293T细胞；离心聚上清液，用微膜过滤，滤液再离心弃上清液，溶解，得到浓缩慢病毒；3)MDCK细胞前处理：将MDCK母本悬浮细胞加至培养基后贴壁培养，稳定传代后得到贴壁细胞，接种至孔板内，加完全培养基进行培养，确认细胞在30‑50％汇合度，消化计数并更换培养液；溶解步骤2)的浓缩慢病毒进行感染；4)抗性筛选：在培养基内加入梯度浓度的嘌呤霉素进行预实验，选择在三天内能够完全杀死细胞的浓度作为最终浓度，用含嘌呤霉素的培养基持续药筛后，收集抗性细胞；5)驯化：使用FBS的DMEM培养基培养传代稳定后，加入无血清培养基进行驯化，再次传代稳定，得到表达鸡ST3GAL 1基因的MDCK稳转细胞株。
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