[发明专利]一种纳豆芽孢杆菌清液发酵制备维生素K2的方法

摘要

一种纳豆芽孢杆菌清液发酵制备维生素K2的方法，包括原料预处理与培养基配制、真空蒸煮处理、高温复合酶处理、蛋白酶处理、低温等离子体处理、除渣处理和发酵培养。本发明采用低温等离子体技术与蛋白酶酶解技术结合，在减压蒸煮条件下对高固形物含量的半合成培养基进行预处理，以形成清液，避免高固形物含量培养基的一系列缺点；同时，经过预处理的半合成培养基，无需再进行高压湿热灭菌，减少能耗的同时降低了培养基的黏度，有利于后期的发酵生产与分离纯化。

主权项

1.一种纳豆芽孢杆菌清液发酵制备维生素K₂的方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：将混合原料粉、蛋白胨、氯化钠、K₂HPO₄、MgSO₄和水混合均匀，使混合后物料的绝对氮含量为5~8g/L、蛋白胨浓度为30~100g/L、氯化钠浓度为1.8‑2.3g/L、K₂HPO₄浓度为1.2‑2.0g/L、MgSO₄浓度为0.3‑0.6g/L，得到培养基，备用；步骤2：将所述培养基置入一蒸煮罐内，然后抽真空，接着将所述蒸煮罐内的气压维持在‑0.5~‑0.3Mpa，并在80~90℃条件下加热15~25分钟，在加热过程中以100~250rpm的转速对培养基进行搅拌；步骤3：调整蒸煮罐内的培养基的pH值至6.0~7.0，加入耐高温α‑淀粉酶溶液，维持步骤2的温度，调整蒸煮罐内的气压为‑0.2~‑0.05MPa，处理30‑60分钟；接下来调整蒸煮罐内温度为45‑55℃，pH值为5.0~6.0，加入纤维素酶溶液和木聚糖酶溶液，搅拌处理30‑60分钟；步骤4：蛋白酶处理将步骤3所获得的培养基降温至30‑40℃，每升培养基添加1~6ml的纤维蛋白溶解酶溶液，调节pH为6.0~7.0，以搅拌转速450rpm‑1000rpm，搅拌30~90分钟；步骤5：将蒸煮器中的温度维持在25~40℃，以转速为100~250rpm进行搅拌，以氮气吹扫蒸煮器的腔体，氮气流速为0.1‑1L/min，持续5‑10min，然后将蒸煮器内的培养基以0.2‑2 L/min流速通过低温等离子体处理设备，获得低温等离子体处理后的培养基；步骤6：将步骤5得到的低温等离子体处理后的培养基用板框过滤器过滤后得到的清液即为发酵培养基；步骤7：发酵制备维生素K₂，包括下列步骤：S1、将甘油管或斜面中保存的菌液活化后，接种于培养基A中，培养得到第一培养液，然后将第一培养液接种于培养基B中，培养得到第二培养液，然后将第二培养液接种于培养基C中，培养获得高活力种液；所述培养基A：葡萄糖8‑12g/L，蛋白胨8‑12g/L，NaCl4‑6g/L，用水溶解后，调整pH值为7.0~7.4；培养基B：葡萄糖3‑5g/l，蛋白胨12‑18g/l，NaCl 3‑5g/l，K₂HPO₄0.8‑1.2g/l，用步骤6获得的清液溶解后，调整pH值为6.5~7.0；培养基C：蛋白胨25‑35g/l，NaCl 1.5‑2.5g/l，K₂HPO₄1‑2g/l，MgSO₄0.4‑0.6g/l，用用步骤6获得的清液溶解；S2、将S1步骤的到的高活力种液接种至所述发酵培养基进行培养。