[发明专利]一种利用重组毕赤酵母表达芳香族异戊烯基转移酶合成维生素K2的方法

摘要

本发明公开一种利用重组毕赤酵母表达芳香族异戊烯基转移酶合成维生素K2的方法，在不需要甲醇诱导的条件下，就能够高效地组成型表达膜结合型芳香族异戊烯基转移酶UBIAD1，并分泌到胞外，从发酵液的上清中可直接获取具有生物活性的UBIAD1，不仅简化了膜蛋白复杂的提取工艺，还提高了蛋白的表达量。上清液中UBIAD1可用于维生素K2的生物合成。

主权项

1.一种重组的毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：根据UBIAD1的基因序列，设计引物如下：UBIAD1‑F‑XhoI: 5’‑CCGCTCGAGAAAAGAGCGGCCTCTCAGGTCCT‑3’；UBIAD1‑R‑NotI: 5’‑ATAAGAATGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGAATTTTGGGCAGACTG‑3’；以pcDNA3.1‑3xFlag质粒为模板，利用引物UBIAD1‑F‑XhoI和UBIAD1‑R‑NotI进行PCR扩增获取含UBIAD1基因完整开放阅读框的片段，然后使用限制性内切酶XhoI和NotI进行双酶切，并胶回收纯化酶切片段；步骤2：将pGAPZαA质粒转化到大肠杆菌DH5α中，在zeocin抗性的低盐LB筛选平板上挑取单菌落，接种于含有zeocin的低盐LB液体培养基中，培养10‑20h后从菌液中提取pGAPZαA质粒，然后使用限制性内切酶XhoI和NotI对提取的pGAPZαA质粒进行双酶切，并胶回收纯化酶切片段；步骤3：将步骤1得到的纯化酶切片段和步骤2得到的纯化酶切片段进行连接后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在zeocin抗性的低盐LB筛选平板上筛选正确连接的阳性克隆pGAPZαA‑UBIAD1得到重组大肠杆菌DH5α，然后挑取重组大肠杆菌DH5α单菌落接种到含有zeocin的低盐LB培养基的三角瓶中，培养12‑16 h后从菌液中提取得到重组质粒；步骤4：使用限制性内切酶BspHI对步骤3得到的重组质粒进行线性化，然后通过电转化的方法，整合到毕赤酵母GS115的感受态细胞中，然后从组氨酸营养缺陷的zeocin抗性平板上筛选到重组毕赤酵母GS115‑pGAPZαA‑UBIAD1。